牦牛血红细胞超声破碎条件优化

文 / 康克龙 何守贵 李晓鹏 文鹏程 赵保堂 张卫兵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070；甘肃嘉泰信息科技有限公司，甘肃兰州，730030）

牦牛血红细胞超声破碎条件优化

文 / 康克龙 何守贵 李晓鹏 文鹏程 赵保堂 张卫兵*

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州，730070；甘肃嘉泰信息科技有限公司，甘肃兰州，730030）

为了提高牦牛血红细胞破碎率，采用单因素和正交试验设计，以新鲜的牦牛血为原料，对影响血红细胞破碎率的破碎功率、破碎时间、血细胞浓度、破碎时间间隔四个单因素进行了优化。结果最佳超声破碎条件表明：超声破碎红血细胞的最优条件是破碎功率为200W、破碎时间为15min、血细胞浓度为5:1、时间间隔为6/9，破碎率达到65.23%。

牦牛；血细胞；破碎

血红素是由一个二价铁离子镶嵌在一个原卟啉环而构成的称为铁卟啉的化合物，主要存在于动物的血液和肌肉中，是动物血液中的天然色素，具有重要的生理功能和很高的实用价值，在医药、食品、化工、保健品等行业中有广泛的应用。动物血液是提取血红素的优质来源[1-3]。血红素主要存在于血液的红细胞内，红细胞经过破碎才能提取到血红素[7-9]。目前，常用的细胞破碎方法有高速匀浆法、酶溶法、化学渗透法等，但是大多存在处理时间长、易造成产物抑制、胞内物质释放率低、化学毒性较强等缺点[10-12]。超声破碎操作简单，液量损失少，采用此方法不但降低了生产成本和生产周期，而且还避免了使用对环境有污染的氯仿和吡啶等溶剂。

我国牦牛数量多，牦牛血资源丰富，并且牦牛血液中血红蛋白(Hb)含量很高，从牦牛血液中提取血红素，原料独特丰富，成本较低，同时能够产生巨大的经济效益和社会效益[4-6]。本试验以新鲜牦牛血原料，研究超声破碎功率、时间、细胞浓度和时间间隔等因素对破碎牦牛血红细胞的影响，寻找最佳的牦牛血红细胞破碎工艺参数，以提高红细胞破碎率。

1 、材料与仪器

1.1 原料和试剂

原料：牦牛血，康美现代农牧产业集团公司提供。

试剂：冰醋酸、氯化钠、丙酮、无水乙醇、氯仿、NaOH、HCl等。

1.2 试验仪器

电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），高速台式冷冻离心机（TGL-20MC，长沙平凡仪器仪表有限公司），小型高速粉碎器（XHF-D，宁波新芝生物科技股份有限公司），超声波细胞粉碎机（Scient2-IID，宁波新芝生物科技股份有限公司），生物显微镜（DYS-328，上海点应光学仪器有限公司），血球计数板，旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），循环水真空泵（SAI-III，上海亚荣生化仪器厂）等。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

新鲜牦牛血液→离心→稀释→超声破碎→检测破碎率

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 细胞浓度对超声破碎效果的影响

调整血细胞浓度为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，设定超声波功率为200W，时间间隔为6/9，破碎15min，超声破碎后测定破碎率，考察细胞浓度对超声破碎效果的影响。

1.3.2.2 超声破碎时间对超声破碎效果的影响

将破碎仪的工作时间分别设定为5、10、15、20、25 min，调整血细胞浓度为5:1，设置功率为200W，时间间隔为6/9时，超声破碎后测定破碎率，考察破碎时间对超声破碎效果的影响。

1.3.2.3 超声破碎功率对超声破碎效果的影响

破碎仪功率分别设定为100W、150W、200W、250W、300W，调整血细胞浓度5:1，设置时间间隔为6/9，破碎15min，超声破碎后测定破碎率，研究破碎功率对超声破碎效果的影响。

1.3.2.4 超声破碎时间间隔对超声破碎效果的影响

将时间间隔设置为2/9、4/9、6/9、8/9，调整血细胞浓度为5:1，破碎功率设定为200W，破碎15min，超声破碎后测定破碎率，研究时间间隔对超声破碎效果的影响。

1.3.3 正交试验

在单因素试验的基础上，选择破碎时间、破碎功率、血细胞浓度、时间间隔4个影响血细胞破碎率的因素进行正交试验，研究上述因素的综合效果。

1.3.4 破碎率的测定[13]

将超声破碎前后的细胞悬液分别稀释至适当倍数后，在显微镜下观察，用血球计数板对完整形态细胞进行计数，计算细胞破碎率，每组统计3次取平均值。

式中：A1为破碎前的细胞计数结果；A2为破碎后的细胞计数结果。

2 、结果分析

2.1 单因素试验

2.1.1 血细胞浓度对血细胞破碎率的影响

图1 不同血细胞浓度对细胞破碎率的影响

细胞浓度影响着悬浮液的流变特性，从而会影响细胞破碎率。由图1可以看红细胞浓度较高或较低都不利于细胞破碎。当V水:V血细胞为3:1时，细胞的破碎率为46.67%。随着水添加量的增加细胞破碎率逐渐升高，当V水:V血细胞为5:1时，细胞破碎率达到最大，为60.67%。而后随着水添加量的继续增加，细胞破碎率反而开始缓慢下降。当V水:V血细胞为7:1时，细胞破碎率为55%。因此，选择红细胞的最佳浓度是V水:V血细胞为5:1。这是因为细胞浓度直接影响溶液的度，从而影响超声波在液体中的空化效应。溶液稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨胀的作用，影响破碎效果[14]。

2.1.2 超声破碎时间对血细胞破碎率的影响

图2 不同超声破碎时间对血细胞破碎率的影响

破碎时间也是影响细胞破碎率重要因素之一。由图2可以看出，当细胞破碎时间为5min时，细胞破碎率只有34%。随着时间的延长，细胞破碎率迅速增加，当破碎时间为15min时，细胞破碎率达到了46.33%。而后随着时间的继续延长，破碎率开始缓慢增加，当破碎时间为25min时，细胞破碎率为48.86%。主要原因是超声破碎时间过短，不能有效地破坏红细胞细胞壁，破碎时间长，会使破碎过程中产生更多的热，使得溶液液出现泡沫，并且由于时间过长细胞过于破碎，导致大量蛋白质和其他杂质被提取出来，增加后续提取分离的难度[15]。因此，选择15min为最佳细胞破碎时间。

2.1.3 超声破碎功率对血细胞破碎率的影响

超声破碎输出功率反映了超声波能量的大小，也是影响细胞破碎率的重要因素。超声破碎功率过小会造成细胞破碎率低，破碎不完全，输出功率的增大有利于液体中空穴的形成，但是输出功率过大，由于超声波处理空化作用引起的细胞液局部的高温高压，会引起样品飞溅或产生泡沫[16]。由图3可以看出，超声破碎功率对细胞破碎率有很大的影响, 输出功率的增大有利于液体中空穴的形成,产生更多的空化泡，使破碎作用增强。当破碎功率由100W升高到200W时，细胞破碎由31.33%迅速的增加到了46%。但当功率提高至200W以后时，破碎率增加趋势很小，因此将200W确定为最佳破碎功率。

图3 不同超声破碎功率对血细胞破碎率的影响

2.1.4 超声破碎时间间隔对血细胞破碎率的影响

图4 不同超声破碎时间间隔对血细胞破碎率的影响

工作时间／间歇时间是超声破碎过程中的重要因素之一，其直接影响细胞破碎率，而且不同时间间隔还会引起超声破碎过程中热效应和空化效应的改变[16]。由图4可以看出，当超声时间为2s时，细胞破碎率为36.67%。之后随着工作时间的增加细胞破碎率迅速增加，当工作时间为6s时，细胞破碎率增加到了57%。再随着工作时间增加到8s时，细胞破碎率反而下降为54.67%。原因是采用短时多次超声波辐射的工作方式有利于细胞破碎，而延长每次超声波辐射时间、减少辐射次数的工作方式使破碎率明显降低。超声波通过空化效应破碎细胞的过程实际就是空化泡形成、振动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程，这一过程需要一段短暂的时间来完成，短时多次的工作方式能使超声波产生的空化泡，有足够的时间和更多机会完成膨胀和爆炸过程, 因此有利于细胞的破碎[17]。因此，选择工作时间／间歇时间为6/9是最佳条件破碎时间间隔。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选择血细胞浓度、超声破碎时间、功率和时间间隔4个影响血细胞破碎率的因素进行正交试验。正交试验因素水平表见表1，正交实验结果见表2。

表1L9( 34)正交试验因素水平表Table1Orthogonal layout of factors and number of level L9( 34)

表2正交实验结果Table2The result analyses of orthogonal experiment

从极差分析可知，破碎时间（A）、破碎功率（B）、血细胞浓度（C）、时间间隔（D）四因素对血细胞破碎率的影响大小为A>D>C>B，最佳超声波破碎血细胞的组合为A2B3C1D3，即破碎时间为15min、破碎功率为200W、血细胞5:1、时间间隔6/9为血细胞破碎的最佳条件，即破碎率达到65.23%。

选取最佳组合A2B3C1D3进行验证试验，3次重复试验的平均破碎率为66.12%，与正交试验的破碎率差异不显著。

3 、结论

本试验通过血细胞浓度、破碎功率、破碎时间、时间间隔四个单因素试验和正交试验及其验证试验确定出最佳细胞破碎条件为:血细胞浓度5:1、破碎功率200W、破碎时间15min、时间间隔6/9，破碎率达到65.23%。

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兰州市科技计划项目(2014-2-29) ；甘肃农业大学SRTP项目(20141030)