贵州省钩端螺旋体血清群特异性PCR鉴定结果与分析

刘 英,陈 红,李沛丽,马 青,王定明,唐光鹏,姚光海,周敬祝,陈峥宏，李世军

贵州省钩端螺旋体血清群特异性PCR鉴定结果与分析

刘 英1,2,陈 红3,李沛丽4,马 青1,王定明1,唐光鹏1,姚光海1,周敬祝1,陈峥宏2，李世军1

目的 采用血清群特异性PCR技术了解贵州省近年钩端螺旋体(钩体)流行菌群，为贵州省钩体病的防控提供技术手段和科学依据。方法 采用致病性钩体特异性PCR方法(G1/G2-PCR)对来自贵州省近年的钩体分离菌株进行鉴定，进一步应用基于致病性钩体O抗原基因的血清群特异性PCR(O-PCR)对贵州省近年的58株钩体分离株进行血清群鉴定，并采用显微凝集试验(MAT)对O-PCR方法的检测结果进行验证。结果 G1/G2-PCR检测结果显示58株菌株均为致病性钩体，O-PCR将58株致病性钩体菌株鉴定为黄疸出血群，与传统的MAT法鉴定结果一致。结论 O-PCR技术可作为我省钩体快速分群鉴定可靠的实验室诊断技术手段，贵州省近年的钩体流行菌群为黄疸出血群。

钩端螺旋体；血清群；PCR；贵州

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260250 and 81401679), the Guizhou Provincial Talent Training Base Project of Infectious Diseases (No. [2013]15) “Sub-project: Research Team of Natural foci and Insect-borne Infectious Diseases Control and Prevention” (No. RCJD1401), and the Program of Natural Science Foundation of Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention (No. 2013-E2-1) Corresponding authors: Li Shi-jun, Email:zjumedjun@163.com;Chen Zheng-hong:Email:chenzhenghong@gm.c.cdu.cn

由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的钩体病是全球流行的人兽共患传染病。由于钩体通过疫水迅速传播，因而是洪涝、地震等自然灾害发生时重点检测的传染病之一[1]。贵州省属自然灾害高发省份，近年来钩体病发病率虽然有所下降，但散发和局部暴发疫情时有发生，疫情主要集中在黔东南、遵义和铜仁等地区，近几年均有死亡病例报告。了解钩体地方菌株的流行菌群对当地钩体病的预防和控制至关重要，本研究采用新近报道的基于钩体O抗原基因的我国6个钩体血清群特异性PCR技术[2]对贵州省近年分离的58株菌株进行鉴定和分析，为贵州省钩体病的防控提供技术手段和科学依据。

1 材料与方法

1.1 钩体菌株与培养 钩体菌株为2010-2014年间自贵州省榕江县、黎平县、锦平县的黑线姬鼠Aa(Apodemusagrariuspallas)鼠肾中分离的58株钩体疑似菌株(表1)。致病性钩体黄疸出血群(Icterohaemorrhagiae)、赛罗群(Sejroe)、犬群(Canicola)、秋季群(Autumnalis)、流感伤寒群(Grippotyphosa)和七热群(Hebdomadis)参考菌株，由中国疾病预防控制中心钩体实验室提供。钩体参考菌株和分离菌株采用含8%兔血清的EMJH培养基于28 ℃培养5～7 d[3]。

表1 黑线姬鼠钩端螺旋体分离菌株背景信息

Tab.1 Background information of 58 strains pathogenic Leptospira isolates isolated fromApodemusagrarius

CountyStrainNo.Year榕江Rongjiang黎平LipingG302010G322010LP62201012LP75201212LP64201212LP79201212LP99201212-80201213-9201313-13201313-69201313-76201314-1201414-4201414-5201414-7201414-10201414-112014

表1(续1)

1.2 诊断试剂 EMJH钩体培养基为美国BD公司产品(批号：0010120)，硅胶膜型TM基因组DNA提纯试剂盒为北京赛百盛基因技术有限公司产品，实验中所用PCR引物和PreMix反应体系由北京天一辉生物科技有限公司提供，DNA Marker为TaKaRa公司产品，钩体分群诊断血清由中国药品生物制品检定所提供。

1.3 核酸提取 采用DNA提取试剂盒，按照说明书操作提取经培养5～7 d后的钩体菌株DNA[4]。

1.4 致病性钩体PCR鉴定 采用致病性钩体特异的G1/G2-PCR方法对58株钩体分离菌株进行鉴定[5]。采用25 μL PCR反应体系，其中含Pre Mix Taq 12.5 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，去离子水7.5 μL。PCR扩增参数为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s、35个循环；72 ℃延伸10 min，产物采用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5 血清群特异性PCR鉴定 按照参考文献[2]提供的我国常见的黄疸出血群、赛罗群、犬群、秋季群、流感伤寒群和七热群特异性引物及参数对58株钩体分离株进行检测，同时采用6个钩体血清群参考菌株做阳性对照，采用去离子水做阴性对照，扩增体系为25 μL，其中含Pre Mix Taq 12.5 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，去离子水7.5 μL，PCR扩增参数为95 ℃预变性2 min，95 ℃30 s、退火30 s(退火温度见表2)、72 ℃1 min，30个循环，产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

表2 钩端螺旋体血清群特异性PCR检测目的基因及引物序列

1.6 验证试验 按照参考文献提供方法对58株钩体分离菌株采用MAT方法进行血清群鉴定[1]。

2 结 果

2.1 致病性钩体PCR鉴定结果 基于G1/G2引物的致病性钩体特异性PCR检测结果显示，58株钩体疑似菌株和阳性对照菌株核酸均扩增285 bp大小的的扩增片段，而阴性对照未出现扩增条带(图1为部分分离菌株G1/G2-PCR扩增条带)。

M: Mark; 1-18: Strain number G30, JP15, 11JP19, LP62, 12JP13, 12LP75, 12LP64, 12LP79, 12LP99, 12-80, 11JP13, 13-135, G32, 13-9, 13-13, 13-69, 13-76, 13-133; 19: Icterohaemorrhagiae; 20: Hebdomadis; 21: Autumnalis; 22: Grippotyphosa; 23: Canicola; 24: Sejroe; 25: Negative control.

图1 致病性钩体特异性PCR检测结果

Fig.1 Identification ofLeptospirausing G1G2-PCR.

2.2 钩体血清群特异性PCR鉴定结果 血清群特异性PCR鉴定结果显示，58株钩体菌株经钩体黄疸出血群特异性引物检测均出现590 bp的预期扩增片段(图2为部分菌株黄疸出血群检测结果)，而经赛罗群、犬群、秋季群、流感伤寒群和七热群特异性引物扩增后均未获得扩增条带。6个血清群参考菌株经相应的血清群特异性引物扩增后均出现预期的目标条带，而其余引物及阴性对照均未出现扩增条带(图3)。

M: Mark; 1-18: G30, JP15, 11JP19, LP62, 12JP13, 12LP75, 12LP64, 12LP79, 12LP99, 12-80, 11JP13, 13-135, G32, 13-9, 13-13, 13-69, 13-76, 13-133; 19: Icterohaemorrhagiae; 20: Hebdomadis; 21: Autumnalis; 22: Grippotyphosa; 23: Canicola; 24: Sejroe; 25: Negative control.

图2 钩体分离株黄疸出血群特异引物PCR检测结果

Fig.2 Identification ofLeptospirausingLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae specific PCR

M: Mark; 1: Icterohaemorrhagiae; 2: Hebdomadis; 3: Autumnalis; 4: Grippotyphosa; 5: Canicola; 6: sejroe; 7: Negative control.

2.3 MAT检测结果 MAT检测结果显示，58株钩体分离菌株均与我国钩体15群15型钩体参考菌株抗血清中的黄疸出血群代表菌株抗血清发生凝集反应，而与其余的赛罗群、犬、秋季、流感伤寒、七热、爪哇、拜伦、致热、澳洲、波摩那、明尼、巴达维亚、塔拉索夫和曼耗群代表菌株抗血清不发生凝集反应。

3 讨 论

钩体病是由致病性钩体引起的一种全世界广泛流行的人兽共患传染病，钩体血清群、型众多，其自然宿主动物也多达200余种，其中以猪、牛等家畜和黑线姬鼠、黄毛鼠等啮齿类带菌动物对人类危害最大。带菌动物从尿液或粪便排出致病性钩体污染水源或土壤，人类接触污染了致病性钩体的疫水/疫土而感染[1,6]。

贵州省疾病监测网络系统显示，贵州省近年来钩体病发病率虽然有所下降，但病死率却呈上升趋势，散发和局部暴发疫情时有发生，疫情主要集中在黔东南、遵义市和铜仁等地区，近几年每年均有死亡病例报告。钩体病疫情发生后，一项非常重要的工作就是迅速确定传染源种类和病原体的鉴定，从而为病人治疗和疫情控制提供科学依据。钩体菌群菌型复杂、分布广泛，现己发现致病性钩体有18个血清群75个血清型[1, 7]。传统的钩体分群方法是显微镜凝集试验[1]，该方法存在工作繁琐、耗费时间、主观性较强等缺点，且需要保存大量的参考菌株并制备各菌株的免疫血清，目前国内一般的钩体病实验室均不能开展血清学分型鉴定，这对钩体病暴发疫情的调查和应急处理十分不利。

随着分子生物学技术的发展，相继出现了一系列的分子分型技术如脉冲场凝胶电泳(PFGE)[8-9]、多位点重复序列分析(MLVA)[9-11]和多位点等位基因测序分型(MLST)[12-13]等技术，且分析结果与钩体血清群具有较好的一致性，在钩体的鉴定及传染源的追踪方面发挥了一定作用。然而， PFGE技术所需试剂种类与操作步骤繁多、技术要求较高、耗时较长、需要专业软件分析和参考菌株PFGE数据库进行结果判断，MLVA 技术分辨能力虽高，但同样需要专业软件分析和参考菌株MLVA数据库进行结果判断，而MLST需要对各等位基因进行基因序列测定，采用专业软件分析后与参考菌株MLST数据库进行比对，该方法耗时较长，成本较高。以上分子生物学技术存在不利于钩体菌株血清群的快速鉴别。近年来采用血清型PCR技术对病原微生物进行血清群/型鉴定的技术相继出现，该项技术针对病原微生物脂多糖及其合成相关基因在微生物血清群或型水平上的特异性设计引物进行PCR检测而达到血清群/型鉴定的目的，国内学者Cai Cheng-Song等[2]2010年报道，针对钩体脂多糖O抗原特异基因设计的引物可以鉴别我国钩体常见的6个血清群，包括黄疸出血群(Icterohaemorrhagiae)、Sejroe(赛罗群)、Canicola(犬群)、Autumnalis(秋季群)、Grippotyphosa、(流感伤寒群)和Hebdomadis(七热群)，并采用75株参考菌株和40株临床菌株对该方法进行了验证，但未见该方法的广泛应用。

本研究中我们采用Cai Cheng-Song等设计的针对我国常见6个群的钩体血清群鉴定引物对58株钩体疑似菌株进行鉴定，结果显示58株菌株均被扩增出黄疸出血群预期的590 bp的特异性条带，而其余5个血清群特异性引物均未扩增出DNA条带，表明58株菌均属黄疸出血群。为了评估检测结果的可靠性，我们采用MAT实验对O-PCR检测结果进行验证，结果显示O-PCR检测结果与传统的MAT检测方法结果完全一致，符合率为100%。本研究结果提示O-PCR技术可作为钩体快速分群鉴定可靠的实验室诊断技术手段，贵州省近年的钩体流行菌群为黄疸出血群，该研究结果将为贵州省钩体病的预防和控制提供可靠的技术手段和科学依据，对当地钩体病的有效防控具有重要意义。

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Serogroup identification and analysis ofLeptospiraisolates using serogroup specific PCR in Guizhou Province, China

LIU Ying1,2,CHEN Hong3,LI Pei-li4,MA Qing1,WANG Ding-ming1, TANG Guang-peng1,YAO Guang-hai1,ZHOU Jing-zhu1，CHEN Zheng-hong2,LI Shi-jun1

(1.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang50004,China； 2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 3.GuiyangCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Guiyang50004,China4.AnimalScienceCollegeofGuizhouUniversity,Guiyang50004,China)

In order to understand the epidemic serogroup of pathogenicLeptospiraand provide technical methods and scientific basis for the control and prevention of leptospirosis, the serogroup ofLeptospiraisolates collected in Guizhou Province were identified and analyzed by using O-antigen gene based serogroup-specific PCR. A total of 58 strains of leptospires collected from Guizhou Province in recent years were detected with pathogenic leptospire specific PCR (G1/G2-PCR) and further identified using O-antigen gene based PCR (O-PCR) which is specific for the serogroups of pathogenicLeptospira. Results were then confirmed with conventional microscope agglutination test (MAT). G1/G2-PCR detection results showed that all of the 58 isolates were pathogenic leptospires. O-PCR identified the 58 isolates asLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae, which was consistent with the results of conventional MAT. Results of this study indicate that O-PCR can be used as a reliable tool forLeptospiraserogroup identification in Guizhou Province, and the results of O-PCR indicated thatLeptospiraserogroup icterohaemorrhagiae was the epidemic serogroup ofLeptospirain Guizhou Province in recent years.

Leptospira; serogroup; PCR; Guizhou

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.012

国家自然科学基金项目(No.81260250, No.81401679)、贵州省传染病人才培养基地项目(黔人领发 [2013]15)“自然疫源性和虫媒传染病研究团队(No.RCJD1401)”和贵州省疾病预防控制中心科学技术基金项目(No.2013-E2-1)联合资助

李世军，Email：zjumedjun@163.com 陈峥宏，Email：chenzhenghong@gmc.edu.cn

1.贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004; 2.贵州医科大学, 贵阳 550025; 3.贵阳市动物疫病预防控制中心，贵阳 550004; 4.贵州大学动物科学院，贵阳 550025

R514.4

A

1002-2694(2015)12-1146-05

2015-06-01；

2015-08-07