戊二醛癸甲溴铵溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果研究

徐秀荣，刘霞，黄迪海，秦春芝，盛晓丹，张从敬，秦卓明，2∗

（1.山东省健牧生物药业有限公司，济南250100；2.山东省农业科学院家禽研究所，济南250031）

戊二醛癸甲溴铵溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果研究

徐秀荣1，刘霞1，黄迪海1，秦春芝1，盛晓丹1，张从敬1，秦卓明1，2∗

（1.山东省健牧生物药业有限公司，济南250100；2.山东省农业科学院家禽研究所，济南250031）

以大肠杆菌（E.Coli.）和金黄色葡萄球菌（S.A）为杀菌对象，按照常规消毒剂的标准，评价了戊二醛癸甲溴铵溶液（JM）的消毒效果，同时选择国外同类产品（FG）作对照。结果表明：当JM 1∶700稀释时，其对E.Coli.的杀菌率为99.96%；而FG则降至93.00%。当JM在1∶1000稀释时，对S.A.的杀菌率为99.86%；而FG仅为82.04%。当两种消毒剂分别按1∶128稀释时，JM对E.Coli.杀菌率达100%时仅需2 min，而FG则需要5 min才能达到同样的效果。对S.A的杀灭试验则显示出同样的规律。新研制的戊二醛癸甲溴铵溶液杀菌效果明显优于国外同类产品。

戊二醛癸甲溴铵溶液；消毒；杀菌率；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌

伴随着生活水平的不断提高，人们对于食品安全的关注度愈来愈高，已经由传统的数量需求转向质量提高，而规模化、集约化的养殖是确保畜禽产品质量的关键。良好的消毒措施不仅是保护畜禽健康免受疾病困扰的技术保障，而且是显著降低环境病原微生物的关键。因此，规范的消毒措施已成为一种最有效、最便利的预防及控制疾病的手段。高效价优的消毒剂已成为规模化养殖厂的首选。戊二醛癸甲溴铵溶液是我国近年来新推出的一种新型复方消毒剂，它不仅综合了醛类消毒剂和季铵盐的优点，而且二者相互协同，具有双重杀菌效果［1］。武守艳等［2］、伍清林［3］等对戊二醛季铵盐复合制剂进行了临床应用研究，但是，有关戊二醛癸甲溴铵溶液在实验室的相关定量和定性杀菌试验等鲜有报道。为评价戊二醛癸甲溴铵溶液的消毒效果，本实验按照国家兽用消毒剂鉴定技术规范（试行）和消毒和灭菌相关标准进行了研究，并同时选择了国外同类产品，以大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.A）作为杀菌对象，分别进行了定量杀菌试验、定性杀菌试验等，进而探讨该消毒剂的杀菌效果，以期对临床应用提供指导。

1 材料

1.1 试验菌株 大肠杆菌（CMCC44103）购于中国兽医药品监察所；金黄色葡萄球菌（CMCC26003）购于中国兽医药品监察所。

1.2 药品

1.2.1 戊二醛癸甲溴铵溶液 含戊二醛5%、癸甲溴铵5%，以下简称“JM”，由山东省健牧生物药业有限公司研制。

1.2.2 浓缩型消毒剂 含季铵盐12.5%、戊二醛6.25%，以下简称“FG”，由法国某药厂生产。

1.3 试剂 吐温-80、甘氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠均为分析纯，试验用水为纯化水，培养基为普通营养琼脂、LB液体和肉汤培养基。

1.4 仪器 超净化工作台（LCT-IDC-A）、电热恒温培养箱（DHP-420型）、立式压力蒸汽灭菌器（YM50）、电热鼓风干燥箱（101型）、电子天平（YP5102型）和电热恒温水浴锅（XMTD-400型）。

2 方法

2.1 试验依据 按照国家兽用消毒剂鉴定技术规范（试行）［4］和消毒灭菌相关标准［5］进行（简称“规范”）。

2.2 试验菌种的制备及活菌计数

2.2.1 菌悬液的制备 取第三代大肠杆菌（E.Coli.）、金黄色葡萄球菌（S.A.）复苏划线接种于营养琼脂培养基，37℃培养18～24 h，挑取单菌落接种于合适的液体培养基，37℃摇床培养24 h。

2.2.2 活菌计数和稀释 采用10倍稀释和平板计数法计数，重复试验3次，用0.03 mol／L的PBS将菌悬液稀释成含菌107CFU／mL的试验菌液。

2.3 中和剂筛选实验 参照规范和韩杰［6］方法，选用3%吐温-80+1%甘氨酸为中和剂，选择浓度适宜的戊二醛癸甲溴铵溶液（JM），以E.Coli.和S.A为受试菌，分别进行中和试验。试验分为6组，A：消毒剂+菌悬液；B：（消毒剂+菌悬液）+中和剂；C：中和剂+菌悬液；D：（消毒剂+中和剂）+菌悬液；E：PBS+菌悬液；F：PBS+中和剂。结果判定，A不长菌或长菌数远少于B，B长菌数超过100 CFU／mL，C、D、E组间菌数相差不超过10%，F不长菌，则判定所选中和剂及其浓度适宜。

2.4 定量法

2.4.1 在规定时间内不同浓度消毒剂的杀菌试验

结合预试验结果，将2种消毒剂按不同的稀释倍数（对E.Coli：1∶500～1000；对S.A：1∶800～1400）稀释至灭菌的西林瓶中，吸取0.5 mL试验菌液分别加于不同浓度的4.5 mL消毒剂溶液内，置20℃水浴中作用5 min，立即吸取上述菌液混合液1.0 mL，加入9.0 mL中和液混匀；同时以0.03 mol／L PBS液代替消毒液进行上述各步骤，作为对照组；中和10 min后进行平板活菌计数，计算杀菌率。以上实验重复3次，每次做2个平行样，用t检验法分析差异显著性。

2.4.2 消毒剂浓度和作用时间对杀菌效果的影响选择1∶700、1∶800和1∶900三个浓度的消毒液分别对E.Coli.进行杀菌；同时，选择1∶900、1∶1000、1∶1200稀释的三个浓度分别对S.A杀菌。将消毒剂稀释至所需浓度，置西林瓶中，吸取4.5 mL加入试管中，20℃水浴，待试管内液体温度与水浴温度平衡后，在试管中加入0.5 mL菌悬液，混均并开始计时，分别在5、10、30、60 min，各取0.5 mL菌液混合液移入4.5 mL中和剂混匀。中和10 min，取0.1 mL三者混合液采用平板法进行活菌计数；以0.03 mol／L的PBS液代替消毒液同步重复上述步骤，作为对照组；计算杀菌率。以上实验重复3次，每次做2个平行样，用t检验法分析差异显著性。

2.5 定性法

2.5.1 消毒剂浓度选择 将灭菌试管10支排列于试管架上，标记管号。每个试管加灭菌水2.5 mL，放（20±2）℃水浴中。于第1管内加适当浓度消毒液2.5 mL，混匀后取2.5 mL移入第2管，依次混匀，从第2管中取2.5 mL移入第3管，以此类推至第9管，混匀后弃去2.5 mL，第10管中不加消毒液作对照。

2.5.2 消毒剂与细菌作用 将菌液用稀释液配制成含菌量为5×105～5×106CFU／mL的菌悬液。以每半分钟加一管的速度加菌悬液2.5 mL于上述各管中，混匀并记录各管加菌时间。各管分别于加菌后2、5、10、30 min四个不同间隔时间，取出0.5 mL，加入4.5 mL中和剂内，中和10 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL营养肉汤管内，37℃培养48 h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7天。

2.5.3 结果判定 若肉汤管混浊，则表示有菌生长，记为阳性，以（+）表示。若培养至第7天，肉汤管澄清，则表示无菌生长，记为阴性，以（-）表示。无指示菌生长表示达到灭菌。

3 结果

3.1 中和剂筛选结果 由表1可知，含3%吐温-80+1%甘氨酸的溶液符合作为戊二醛癸甲溴铵溶液中和剂的要求，且中和剂与中和产物对E.Coli和S.A无不良影响。三次试验的结果基本一致。

表1 中和剂筛选试验结果表

3.2 定量杀菌试验结果

3.2.1 在规定时间内不同浓度消毒剂的杀菌试验对E.Coli的消毒效果表明：当JM消毒剂在稀释倍数为1∶500、1∶600、1∶700时，其对E.Coli的杀菌率均不低于99.95%，在1∶800时，杀菌效果仍为93.5%；而FG消毒剂在稀释倍数1∶500、1∶600与JM相同，但在1∶700和1∶800的杀菌率仅为93.00%和61.35%，明显低于JM的杀菌效果（表2）。

对S.A的杀菌效果表明：当JM在稀释倍数为1∶800、1∶900时对S.A的杀菌率均为100.0%，在1∶1000的杀菌率为99.86%；而消毒剂FG在1∶800的杀菌率仅为90.52%。消毒剂JM对S.A杀菌效果显著，而消毒剂FG效果不佳（表3）。

表2 消毒剂500～1000倍稀释与大肠杆菌作用5 min的杀菌效果表

表3 消毒剂800～1400倍稀释与金黄色葡萄球菌作用5 min的杀菌效果表

3.2.2 消毒剂浓度和作用时间对杀菌效果的影响表4和5显示的是消毒剂不同浓度和作用时间对E.Coli和S.A杀灭率的影响。由表4可知：JM在1∶700稀释时对E.Coli完全杀灭的时间不超过5 min，而同等条件下FG至少需要30 min。而在1∶900稀释时，JM对E.Coli完全杀灭的时间为30 min，而FG则需60 min。很明显，在同等条件下，JM对E.Coli的杀灭时间要短，且需要的浓度低，差异显著。对S.A的实验反映出同样的规律（表5）。

表4 消毒剂固定浓度、不同杀菌时间对大肠杆菌的杀菌效果表

表5 消毒剂固定浓度、不同杀菌时间对金黄色葡萄球菌的杀菌效果表

3.3 定性杀菌试验

3.3.1 对大肠杆菌的定性杀菌作用 表6显示的是消毒剂的稀释浓度与E.Coli相互作用时间的相关性。由表6可知，消毒液浓度愈低（稀释倍数大），作用时间愈长，反之，作用时间短。当两种消毒剂分别按1∶128、1∶64倍稀释与E.Coli作用时，JM杀菌率达100%仅需2 min，而FG在1∶128稀释时，则需要5 min才能达到100%的杀菌效果。很明显，JM溶液的稀释倍数更大，有明显差异。进行了三次重复试验，结果是一致的。

表6 消毒剂对大肠杆菌的定性杀菌结果表

3.3.2 消毒剂对金黄色葡萄球菌的定性杀菌作用表7显示的是消毒剂的稀释浓度与S.A相互作用时间的相关性，该结果与表6结论相同。

表7 消毒剂对金黄色葡萄球菌的定性杀菌结果表

4 讨论

4.1 戊二醛是一种速效、广谱的化学灭菌剂，在常温下低浓度的戊二醛水溶液即可对多种微生物表现出杀灭活性，对繁殖型的细菌、病毒、分枝杆菌、致病性霉菌和细菌芽孢等均能杀灭，且对人毒性较低。癸甲溴铵复配性能好，不仅能与阳离子、非离子、两性离子表面活性剂配伍，与乙醇、异丙醇等溶剂复配成复合制剂，耐温、耐光，而且能杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒（如马立克氏病毒、新城疫病毒等）等［7］，属高效消毒剂。戊二醛和癸甲溴铵均为速效、高效的消毒剂，但二者单独使用时皆受到微生物的种类、使用浓度、环境中有机物等因素的干扰，而二者协同更易进入细菌、病毒内部，破坏蛋白质和酶活性，达到快速高效的协同增效作用。此外，二者复合还可降低戊二醛的使用浓度，减少对粘膜的刺激性和对金属的腐蚀性［8］。在预实验中分别进行了10%戊二醛溶液和JM（1∶800倍稀释）两种消毒剂对大肠杆菌的抑菌试验，结果证实JM的抑菌效果最佳，说明制成戊二醛、癸甲溴铵复方制剂后，产品抑菌效果可大大提高。

4.2 研究表明，两种消毒剂产品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的杀灭效果，但杀菌效果与消毒剂的浓度、作用时间等密切相关。其中，在相同的时间内，JM对大肠杆菌杀灭的最佳浓度是1∶700，对金黄色葡萄球菌的浓度为1∶900，而同等条件下，FG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率仅为93.0%和88.05%，明显低于JM的杀灭效果。在相同的浓度下，JM溶液在1∶128对大肠杆菌的最短杀灭时间为2 min，FG溶液至少5 min；对金黄色葡萄球菌显示出类似的结果。因此，该试验证实：JM溶液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果比FG更佳。是否与配方中的癸甲溴铵和季铵盐有存在差别有关？值得进一步研究。

4.3 通常在试验条件下评价消毒剂的杀菌效果时，往往当混合液移到培养基时，不可避免地带有少量残余消毒剂，可能会阻碍细菌在培养基中的进一步生长繁殖，形成阴性结果［9］，所以，在定量杀菌浓度试验时，一般要除去残余的消毒剂的影响。本试验利用含3%吐温-80+1%甘氨酸的溶液符合作为戊二醛癸甲溴铵溶液的中和剂，获得了较好的实验效果，该中和剂不仅能够有效中和消毒剂，而且其浓度并不影响细菌的生长。

4.4 本次试验是对戊二醛癸甲溴铵溶液的初步研究。在实验室条件下证实，该复合溶液（JM）消毒效果不仅优于其中任何一种单品溶液，还优于进口的戊二醛和季铵盐（FG）溶液，且价格仅为进口制剂的40%，因此，可大大降低消毒用药成本，在临床上具有较强的推广价值。该消毒剂对结核杆菌、芽孢、霉菌和病毒等的消毒试验还在进行中，以期为临床消毒提供更加详实的技术支持。

［1］ 邱梅，郝智慧，厐云露，等.国内外兽用消毒剂的研究现状与发展趋势［J］.中国兽药杂志，2011，45（6）：43-47.

［2］ 吴守艳，韩一超，张玉换，等.戊二醛癸甲溴铵消毒剂对几株病原菌的杀灭效果研究［J］.中国兽医杂志，2007，43（11）：70-71.

［3］ 伍清林，金兰梅，张玉红，等.猪舍环境中细菌总数测定和消毒剂对致病菌的敏感性试验［J］.金陵科技学院学报，2012，28（4）：71-78.

［4］ 农业部1992农（牧药）字第101号.兽用消毒剂鉴定技术规范（试行）［S］.

［5］ 袁洽劻，王太星，顾健.GB-15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准［S］.

［6］ 韩杰，魏秋华.化学消毒剂的中和剂研究现状［J］.中国消毒学杂志，2013，30（12）：1165-1168.

［7］ 杨鸿，刘记文，罗秋桃，等.新型季铵盐复方消毒剂对微生物杀灭效果的实验观察［J］.养禽与禽病防治，2010，（4）：12-14.

［8］ 徐文体.戊二醛杀菌作用及毒副反应研究进展［J］.现代预防医学杂志，2003，30（3）：399-400.

［9］ 张冰，秦秀慧，李军，等.戊二醛和季铵盐复合消毒剂对鸡常见病原微生物杀灭效果的研究［J］.中国实验动物学杂志，2002，12（2）：95-98.

（编辑：侯向辉）

Effect Test of Disinfection Compound of Glutaral and Deciquam Solution on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

XU Xiu-rong1，LIU Xia1，HUANG Di-hai1，QIN Chun-zhi1，SHENG Xiao-dan1，ZHANG Cong-jing1，QIN Zhuo-ming1，2∗
（1.Shandong JM Biological Pharmaceutical Co Ltd，Jinan 250100；2.Institute of Poultry Science，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250031，China）

The effects of the newly developed disinfection consisting of glutaral and deciquam solution（JM）were performed on by using Escherichia coli and Staphylococcus aureus as objects according to the testing standard of disinfectant routine，while selecting similar foreign products（FG）as a control.The results demonstrated that when the two disinfectants were diluted at 1∶700，JM’s disinfection rate against Escherichia coli was higher more than 99.96%as well as the FG was only 93.00%.When JM was diluted at 1∶1000，the sterilization rate was 99.86%against Staphylococcus aureus，while the FG was less than 82.04%.Furthermore，when the two kinds of disinfectants against Escherichia coli were diluted at 1∶128，the bactericidal rate by JM was owned by 100%in 2 min，whereas FG for 5min to achieve the same results.The above results confirmed that bactericidal effect of the newly developed glutaral and deciquam solution was significantly better than comparable foreign products，and had a price advantage，worthy of promotion.

glutaral and deciquam solution；disinfection；sterilization rate；Staphylococcus aureus；Escherichia coli

2015-01-07

A

1002-1280（2015）03-0030-05

S859.79

国家自然基金（31372332）、科技部农转资金（SQ2013ECC600059）和济南市成果转化支持项目（2012CG92）

徐秀荣，助理研究员，从事兽药检验分析及新兽药的研发。

秦卓明。E-mail：qinzm1997＠163.com