葛根异黄酮对去卵巢大鼠血管内皮功能的保护作用

张宝荣，谭颖颖，张 琪

大量研究表明，妇女在绝经后失去雌激素对心血管的保护作用，心脑血管疾病发病率显著增加［1］。雌激素替代疗法对改善绝经后妇女的心血管疾病有效，但长期应用外源性激素，有增加子宫内膜癌、乳腺癌等发病率的危险［2］。药理学研究表明葛根的主要有效成分异黄酮具有扩张血管，抑制血小板聚集和抗氧化等作用，其中葛根素、大豆甙和金雀异黄素等具有明显的雌激素样作用［3，4］。雌激素可通过影响内皮细胞功能而实现对心血管的保护作用［5］，但同样具有雌激素活性的葛根异黄酮对绝经后妇女或雌激素缺乏动物内皮功能的影响尚未见有报道。本研究主要观察了葛根异黄酮对去卵巢大鼠血管内皮功能的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 葛根异黄酮由陕西中医学院新药研究中心提供；去甲肾上腺素、乙酰胆碱和硝普钠为Sigma公司产品；兔抗内皮型一氧化氮合酶（eNOS）一抗由Santa Cruz公司提供；Powerlab生物信号记录系统为澳大利亚AD Instrument公司产品；雌二醇（E2）、内皮素（ET）和 一氧化氮（NO）检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验动物和分组 实验选用雌性SD大鼠，体重250g～280g，适应性喂养1周后，随机分成4组：假手术组（Sham）、卵巢切除组（OVX）、卵巢切除＋葛根异黄酮大剂量组（OVX＋TIPH）、卵巢切除＋葛根异黄酮小剂量组（OVX＋TIPL）。实验动物由西安交通大学实验动物研究中心提供。

1.3 去卵巢大鼠模型和给药方法 大鼠2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，下腹部术区剪毛，仰卧位固定。严格消毒后，无菌条件下行下腹正中切口，逐层分离进入腹腔，辨别出双侧卵巢后，完整切除，并逐层缝合切口。假手术组大鼠行相同手术过程，但不切除卵巢。术后第3天，将卵巢切除大鼠随机分为3组，给予药物灌胃。大剂量和小剂量治疗组分别给予葛根异黄酮150 mg／kg和50mg／kg，给药体积为1mL／100g体重，时间为12周。对照组大鼠给予等体积生理盐水。大鼠在温度22℃，湿度30%～40%的环境中饲养，自由饮水和摄食。

1.4 血清学检测 各组大鼠经以上药物处理后，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，下腔静脉取血，分离血清，使用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清雌二醇和内皮素含量。硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）水平。以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 主动脉血管内皮功能的检测 分离各组大鼠的主动脉，置于预冷的Kerb’s液中。将附着动脉的结缔组织剥离后，切制为宽约3mm的动脉环形标本。在含Kerb’s液的37℃浴槽中，将动脉环悬挂，另一端连于张力换能器，并持续给予95%O2＋5%CO2的混合气。张力换能器连接于Powerlab生物信号系统，记录和分析动脉环张力变化情况。当动脉环稳定于基线后，浴槽中加入去甲肾上腺素（NE，106mol／L）收缩血管环，待动脉环收缩达平衡状态后，分别加入浓度为（10－9～10－5）mol／L的内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱（ACh），观察血管的舒张反应。然后，洗脱血管，重新平衡至基线，改用累加浓度为10－9～10－5mol／L的非内皮依赖性血管舒张剂硝普钠（SNP）重新舒张血管，测定各组非内皮依赖性血管舒张功能。

1.6 Western blot提取蛋白后Bradford法测定蛋白含量。上样后，SDS－AGE凝胶电泳分离蛋白。电泳结束后，湿转法将蛋白从聚丙酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜。室温下，脱脂奶粉（5%）封闭2h。兔抗内皮型一氧化氮合酶一抗（1∶500），4℃ 孵育过夜。TBS漂洗3次后，加入标记辣根过氧化物酶的IgG二抗，室温孵育30min。漂洗3次膜后，在暗室里加入ECL显色2min，并曝光胶片（1～2）min，采用图像分析系统进行分析蛋白印迹结果。

1.7 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，使用sigmastat 3.0软件处理。

2 结 果

2.1 血清E2、ET和NO水平变化 卵巢切除12周后，OVX组大鼠的E2和NO水平较Sham组大鼠显著降低（P＜0.01），ET水平显著增高（P＜0.01）。术后给予葛根异黄酮干预后，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH组大鼠的E2、ET和NO水平与OVX组间均有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清E2、ET和NO水平变化（x±s）

2.2 血管舒张反应变化 在Sham组，加入浓度为（10－9～10－5）mol／L的内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱后，动脉环呈现浓度依赖性舒张；而在OVX组，动脉环对乙酰胆碱的舒张反应出现显著性障碍（P＜0.01）。给予葛根异黄酮干预后，与OVX组相比，OVX＋TIPL和OVX＋TIPH组的动脉环对乙酰胆碱的舒张反应显著性增高（P＜0.05，见图1A）。使用浓度为10－9～10－5mol／L的非内皮依赖性血管舒张剂硝普钠舒张血管，各组血管环对硝普钠的舒张效应无统计学意义（见图1B）。

图1 各组大鼠内皮依赖性血管舒张反应变化

2.3 内皮组织eNOS蛋白的表达变化 OVX组较Sham组大鼠eNOS表达显著降低（P＜0.05），而OVX＋TIPL和OVX＋TIPH组与OVX组间均有统计学意义（P＜0.05）。详见图2。

图2 各组大鼠内皮组织eNOS蛋白的表达变化

3 讨 论

血管内皮细胞是血管腔表面的单层上皮，形成血管的内壁。其不仅是循环血液与血管平滑肌间的屏障，也是人体重要的内分泌器官。血管内皮细胞受损是心血管疾病早期事件之一，也是多种心血管疾病形成的关键病理特征。在正常和受损状态下，内皮细胞可分泌多种血管活性物质，如内皮素、血管紧张素Ⅱ、血栓素 A2、一氧化氮、前列环素、缓激肽等［5，6］。其中，一氧化氮和内皮素是关键的活性分子。动脉内皮功能受损时，一氧化氮的合成和释放减少，内皮依赖性的舒张功能出现下降。用乙酰胆碱诱导的内皮舒张反应是评估血管内皮舒张功能的经典方法［7］。乙酰胆碱对正常的动脉表现为舒张反应，而在内皮功能受损时则出现舒张反应降低或出现收缩反应。本研究结果显示，与对照组比较，去卵巢大鼠的内皮依赖性舒张反应显著下降，而不同剂量的葛根异黄酮可以不同程度的改善受损的内皮依赖性舒张反应，其中150mg／kg葛根异黄酮作用较强。另外，L－NAME预处理可明显阻断葛根异黄酮对去卵巢大鼠血管的舒张反应，提示葛根异黄酮增加去卵巢大鼠主动脉血管的舒张反应依赖于一氧化氮。而血清检测也发现，葛根异黄酮可以显著增加去卵巢大鼠的一氧化氮水平，并降低内皮素的含量。这说明葛根异黄酮可以显著改善去卵巢大鼠受损的内皮功能，具有保护血管内皮的作用。

雌激素受体可表达分布于动物和人的血管内皮细胞、平滑肌细胞［8］。雌激素替代治疗可改善绝经期妇女血管内皮细胞的内分泌功能，调节血管的舒张功能，并可增加一氧化氮合酶的转录和表达，促进一氧化氮的合成和分泌，提高一氧化氮的活性。表明雌激素可以通过一氧化氮途径改善受损血管内皮介导的舒张反应。已有研究发现异黄酮genistein和大豆黄酮等对雌激素受体的选择作用比雌二醇高（2～10）倍左右，大豆黄酮是葛根异黄酮的成分之一［9］。因此葛根异黄酮可能通过雌激素受体直接影响动脉内皮功能。葛根异黄酮可以显著增加去卵巢大鼠的雌激素水平。这说明葛根异黄酮改善内皮功能与其类雌激素样作用有关。

本研究发现去卵巢大鼠的内皮细胞eNOS的表达降低，而葛根异黄酮可以上调异常的eNOS表达。eNOS表达于血管内皮细胞，可以在L－Arg和分子氧为底物下合成一氧化氮，调控内皮功能。该结果提示葛根异黄酮也可以通过直接或间接影响eNOS表达，发挥内皮保护效应。葛根异黄酮具有保护去卵巢大鼠血管内皮的功能，其机制与类雌激素样作用、上调eNOS表达和降低内皮素水平等因素有关。

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