单纯高血糖诱发大鼠动脉粥样硬化的实验研究

唐 英，吴晓牧，胡 凡，柴 文，胡国柱，吴梨华，张昆南

糖尿病（DM）患者大血管病变是其死亡的主要原因，其心、脑血管疾病的发病率均显著高于非糖尿病人群［1，2］。但单纯高血糖与动脉粥样硬化的关系及其可能机制仍不十分清楚。本研究以单纯高血糖为特征的2型糖尿病模型大鼠为研究对象，观察高血糖是否能引起颈动脉脂纹、脂质斑块形成，以及其与血糖、血脂、同型半胱氨酸及果糖胺之关系，探讨糖尿病动脉粥样硬化的形成和发展机制。

1 材料与方法

1.1 材料 12周龄SPF级SD雄性大鼠（260g～280g）50只（购自湖南斯莱克景达实验动物中心），40%脂肪的胰岛素抵抗诱导模型食料（上海斯莱克实验动物有限责任公司），大鼠胰岛素（INS）酶联免疫试剂盒（美国 Millipore公司），全自动生化仪（日本HITACHI 7600－120）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组 SD雄性大鼠适应性喂养1周后按体重随机分为正常对照组（对照组12只）和糖尿病模型组（38只），均高脂饲料喂养，每只大鼠每天定量25g，自由饮水，自然昼夜照明，相对湿度为50% ～70%，室温（22～24）℃。4周后，隔夜空腹12 h，造模组大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）溶液35mg／kg；对照组腹腔注射0.1mol／L柠檬酸钠缓冲液。72h后禁食8h～12h大鼠尾静脉采血测定空腹血糖（FBG），以血糖浓度＞16.7mmol／L以上为2型糖尿病大鼠模型造模成功，达到模型标准且未死亡的共30只。30只糖尿病模型大鼠随机分为糖尿病1月组（DM1组），3月组（DM3组）和5月组（DM5组），每组10只大鼠。但实验终点由于糖尿病模型大鼠出现死亡，因此DM1组最后为9只，DM3组为10只，DM5组为8只。

1.2.2 大鼠体重 采用电子盘称每1周称体重1次。

1.2.3 大鼠血液样本采集 0月，1月，3月，5月空腹大鼠乙醚麻醉后内眦静脉取血，室温放置30min后3 000r／min离心15min分离血清，－80℃保存。

1.2.4 空腹血糖测定 采用已糖激酶法通过全自动生化仪测定外周血空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。

1.2.5 胰岛素测定 采用ELISA方法测定大鼠空腹血清胰岛素，实验步骤严格按照试剂盒说明书实验程序进行，胰岛素含量根据试剂盒标准曲线测得。

1.2.6 血清生化指标测定 三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、同型半胱氨酸 （HCY）和果糖胺（FMN）含量采用全自动生化仪测定。

1.2.7 形态学观察 分别于采血后经水合氯醛腹腔麻醉大鼠，开胸、开腹，夹闭腹主动脉，将连有输液器的针头插入左心室并剪开右心耳，先灌注150mL生理盐水，随后用4.0%多聚甲醛进行灌注。待灌注完成后取出左侧颈总动脉，将所得血管放入装有4.0%多聚甲醛的容器中固定4h～6h，包埋，石蜡切片厚4 μm，切片脱蜡水化，常规HE染色，光镜观察动脉粥样硬化病变。

1.2.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD比较，方差不齐时用秩和检验。相关性分析统计采用Person法。

2 结 果

2.1 各组动脉壁的病理改变 糖尿病组动脉内膜内皮细胞层下基质层变厚，有核细胞增多，核变大，3月时可见血管壁局限增厚，可观察到少许泡沫细胞，5月时泡沫细胞数量未见明显增多，但较3月时多，尚未形成典型粥样斑块，符合动脉粥样硬化的早期病理改变。糖尿病组中膜层结构变疏松，弹性纤维减少，间距变大，许多平滑肌细胞核变大，变圆，细胞变短，由收缩型变为合成型，并出现了平滑肌细胞的迁移。而对照组动脉壁结构平整，内皮细胞光整，排列规则，动脉中膜平滑肌仍为收缩型，为正常大鼠血管。

2.2 各组血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比较 糖尿病各组与对照组比较，FBG，TC，TG，LDLC，HCY，FMN等差异均有统计学意义（P＜0.01）；DM1组 HDL－C 高于对照组（P＜0.01）；各模型组之间FBG，TC，HCY，FMN差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 各组血糖、血脂、同型半胱氨酸和果糖胺水平比较（x±s）

3 讨 论

根据2型糖尿病发病机制，本实验选用SD大鼠先喂以高脂饲料1月诱导胰岛素抵抗，然后一次性腹腔注射低剂量STZ 35mg／kg诱导胰岛素抵抗大鼠产生高血糖。STZ注射后72h时，与正常对照组相比，模型组大鼠FBG急剧增加至16.7mmol／L以上，同时出现多饮、多食、多尿等症状，虽然随着实验进行，模型组血糖水平有逐渐下降的趋势，但是至成模5月后仍高于正常水平，糖尿病模型建立成功且稳定。糖尿病动物模型造模前后均给高脂饲料喂养。

本研究中，用HE染色观察糖尿病大鼠动脉壁结构，发现该糖尿病动物模型动脉壁特点为：内皮细胞层下基质层变厚，有核细胞增多，核变大，变圆，细胞变短，向内皮迁移，内皮细胞聚集变形，形成纤维帽；血管壁局限增厚，可观察到泡沫细胞，至5月时已形成脂纹，此变化符合动脉粥样硬化病理变化的早期改变［3］，中膜层结构变疏松，弹性纤维增生，呈玻璃样变，许多平滑肌细胞由收缩型变为合成型，并出现了平滑肌细胞的迁移。而对照组大鼠动脉内膜层光滑，无脂质沉积，无泡沫细胞，中膜层平滑肌细胞排列整齐，细胞核清晰。上述病理结果提示，糖尿病大鼠已发生动脉粥样硬化，其显著特点是泡沫细胞和脂纹的形成，以及早期出现的平滑肌细胞的变形、迁移和增殖。

动脉粥样硬化是一种脂质相关的慢性炎症免疫疾病，动脉粥样硬化的形成是一个缓慢而复杂的过程，血脂沉积于损伤的动脉内膜，脂肪沉积刺激动脉内壁平滑肌细胞和纤维细胞增生，增生不断发展连成纤维斑块，大量炎症免疫细胞聚集在动脉粥样斑块中［4］，从而造成血管病变、微循环障碍及血液流变学改变，最终导致心脑血管病变发生，严重影响人类健康和生活质量。LDL－C、高浓度的TG和TC已被证实是动脉粥样硬化疾病的主要危险因素［5］。在本研究中，模型组各组的TC、TG、LDL－C与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；说明模型组在血糖升高的同时也伴随着血脂浓度的升高，它们共同促进血管的动脉粥样硬化。

高同型半胱氨酸可能通过以下机制导致动脉粥样硬化、血栓形成及脑梗死的发生：①通过氧化应激损伤血管内皮细胞；②LDL形成复合物后被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞；③刺激血管平滑肌细胞的增殖；④增加血小板凝血烷的合成，破坏机体凝血与纤溶系统之间的平衡；⑤促进细胞凋亡；⑥其他如炎症反应等。通过上述机制过多、过高的同型半胱氨酸可以腐蚀损害血管造成血栓的形成。在本研究中，模型组各组的HCY与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；说明模型组在血糖升高的同时也伴随着HCY浓度的升高，它们共同促进血管的动脉粥样硬化。轻度升高的同型半胱氨酸血症与心脑血管疾病之间无内在的必然联系或联系很小［6］。同型半胱氨酸的致动脉粥样硬化机制仍需要进一步深入研究和探讨。

高血糖动物模型出现了明确的动脉粥样硬化的部分特征性表现，说明高血糖是动脉粥样硬化的一个重要原因；糖尿病动物模型存在高三酰甘油、高胆固醇、高低密度脂蛋白、高同型半胱氨酸及血果糖胺的升高；上述指标的增高可能是糖尿病动脉粥样硬化的危险因素，其作用可能与内皮细胞受损，动脉壁局部炎症介质表达有关，但它们导致动脉粥样硬化的分子机制仍有待进一步的研究。

［1］ Morrish NJ，Wang SL，Stevens LK，etal.Mortality and causes of death in the WHO multinational study of vascular disease in diabetes［J］.Diabetologia，2001，44（suppl 2）：s14－s21.

［2］ Jeerakathil T，Johnson JA，Simpson SH，etal.Short－term risk for stroke is doubled in persons with newly treated type 2diabetes compared with persons without diabetes：A population based cohort study［J］.Stroke，2007，38：1739－1743.

［3］ Peter Libby.Current concepts of the pathogenesis of the acute coronary syndromes［J］.Circulation，2001，104：365－372.

［4］ Ross R.Atheroselerosis－an inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340：115－126.

［5］ Cannon C，Braunwald E，McCabe C，etal.Intensive versus moderate lipid lowering with stains after acute coronary syndromes［J］.N Engl J Med，2004，350：1495－1504.

［6］ Homocysteine Studies Collaboration.Ametaanalysis［J］.J Am Med Assoc，2002，288：2015－2022.