光敏汤对HaCaT细胞表达IL-10影响研究

王丽新

（宁夏医科大学高等卫生职业技术学院基础医学教研室，宁夏 银川 750004）

近年来由于环境污染的日益加剧，平流层臭氧消耗的增加，到达地球表面的紫外线（UV）增多，已成为影响人类健康最重要的环境因素之一。许多皮肤疾病的发生与UV损伤有着密切关系，如光老化、多形性日光疹、红斑狼疮、皮肤肿瘤等。

IL-10是紫外线引起光损伤的重要细胞因子，UV照射后1L-10产生增多，主要来自于角质形成细胞（KC）、黑素细胞和浸润表皮的巨噬细胞，具有较强的抗炎及免疫抑制活性。我们制备不同的动物含药血清作用于经过紫外线照射后的HaCaT细胞，以检测不同动物含药血清对HaCaT细胞分泌IL-10的影响，从而探讨其治疗机制。

1 实验材料

细胞：人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株，购自百奥迈科生物技术有限公司。

实验动物：SD大鼠30只，雌雄各半，体质量250～350g，由宁夏医科大学动物实验中心提供。

仪器设备：超净工作台、全波长酶标仪、紫外可见光分光光度计、紫外线光疗仪、二氧化碳孵箱、超速低温离心机、6孔培养板。

试剂：DMEM/F12培养基、无噬菌体胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、人IL-10ELISA检测试剂盒、EDTA。

药物：实验所用药物均购自银川市中医院药剂科。甲氨蝶呤片（MTX）（上海信谊药厂有限公司生产，国药准字H31020644）。光敏汤Ⅰ号药用白茅根20g，生石膏20g，生地15g，丹皮15g，紫草9g，金银花12g，连翘12g，大青叶15g，藿香10g，佩兰10g，薏苡仁15g，滑石9g，车前子12g，竹叶6g，乌梅10g，防风10g[1，2]。光敏汤Ⅱ号为在光敏汤Ⅰ号基础上加黄芪12g，枸杞子12g，甘草9g。

2 实验方法

中药提取液的制备：由宁夏医科大学药理实验室加工完成。分别称取光敏汤Ⅰ号中药材1200g，光敏汤Ⅱ号中药材1398g（为成人6天的剂量），加6倍的双蒸水浸泡2h，密闭，中火煎煮1h，滤出药液，药渣再加双蒸水4倍，煎煮0.5h，滤出药液，合并2次药液，取上清液，于60℃水浴分别浓缩至400mL（每毫升药液分别含3g、3.5g生药）。

动物血清药配制：取30只SD大鼠随机分为光敏汤Ⅰ号组、光敏汤Ⅱ号组、甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组、UVB阳性对照组及空白对照组，每组6只。2个中药组分别给予相应的中药提取液灌胃（按照人和动物体表面积折算成人2倍的剂量），用量为16mL/（kg·d）；甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组以蒸馏水溶解液灌胃，用量为0.4mg（16mL）/（kg·d）；UVB阳性对照组及空白对照组给予等体积蒸馏水灌胃。每日分2次灌饲，连续5天，在最后1次给药2h后取腹主动脉采血（无菌操作），分离血清，56℃灭活30min后分装，-20℃冻存备用。

细胞接种：将HaCaT细胞冻存管从冷冻箱中取出后立即置于37℃水浴中，轻轻晃动冻存管，解冻细胞。然后将细胞悬液转移至装有10mLMEM培养液的离心管中，用吸管吹打使细胞均匀悬浮。将离心管放入离心机中，20℃，1000转/min，离心5min，弃上清液，加入MEM完全培养液，用吸管吹打均匀后进行细胞计数，并将细胞密度调整为5×105个/mL。再将细胞悬液转移至细胞培养瓶中，每瓶3mL细胞悬液，将其置于37℃，5%CO2的孵育箱中培养，次日更换培养液后继续培养，待细胞贴壁后进行实验。准备8个6孔板（分别供6、12、24、48h检测使用），取培养瓶内亚融合状态、对数期生长的HaCaT细胞，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后制成单细胞悬液，使用细胞计数板计数后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基调整细胞密度至1×105个/mL，转种至6孔细胞培养板，每孔3mL。

HaCaT细胞实验分组：将接种至6孔板的细胞分为5组，光敏汤Ⅰ号组、光敏汤Ⅱ号组、甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组、UVB阳性对照组及空白对照组。待HaCaT细胞完全贴壁后，弃掉培养液，实验组分别加入相应浓度的动物血清培养24h；空白对照组及UVB阳性对照组加入蒸馏水动物血清培养基培养24h。

紫外线照射：加药培养24h后吸弃各孔培养液，PBS洗涤2遍，并用少量PBS覆盖细胞，以30mJ/cm2剂量的UVB照射，照射距离15cm。照射时将空白对照组用无菌锡纸覆盖，并将6孔板置于水浴中接受照射，以防产热。照射完毕吸出PBS，空白对照组及UVB对照组每孔加入DMEM/F12培养液3mL，实验组各孔加入相应浓度的溶液3mL继续培养。

收集细胞及培养上清液：6h、12h、24h、48h后，用Eppendof管收集细胞培养上清液， 每管收集500μL，-20℃保存。待所有标本收集完后采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中IL-10的表达。

用SPSS17.0统计软件分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析进行检验，对各组间的总的比较差别有统计学意义的进一步用LSD法做两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

各组HaCaT细胞表达IL-10的水平比较见表1。空白对照组12h、24h、48h、72h后，上清液中IL-10的浓度为35～39 pg/mL，UVB阳性对照组IL-10为48～71 pg/mL，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与UVB阳性对照组比较，药物治疗组在UVB照射后12h、24h、48h、72h，IL-10的分泌量都有所下降，在紫外线照射24h后，光敏汤Ⅰ、Ⅱ号组与UVB阳性对照组分泌的IL-10有显著统计学差异（P＜0.05）；UVB照射48h后，光敏汤Ⅰ、Ⅱ号组、甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组与UVB阳性对照组分泌的IL-10比较差异有统计学意义（P＜0.05）；UVB照射后72h，光敏汤Ⅰ、Ⅱ号组与UVB阳性对照组分泌的IL-10比较差异有统计学意义（P＜0.05）；光敏汤Ⅱ号组UVB照射后72h，与甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；光敏汤Ⅰ号组与甲氨蝶呤（MTX）组在各个时段分泌的IL-10含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组HaCaT细胞表达IL-10的水平比较 （pg/mL，±s）

表1 各组HaCaT细胞表达IL-10的水平比较 （pg/mL，±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与UVB阳性对照组比较，#P＜0.05；与MTX阳性对照组比较，△P＜0.05。

组别 12h 24h 48h 72h光敏汤Ⅰ号组 45.74±10.61* 49.32±12.12*# 60.21±13.23*# 58.65±11.24*#光敏汤Ⅱ号组 43.85±12.34 47.47±9.15*# 58.46±7.37*# 47.87±13.33*#△MTX阳性对照组 45.56±8.36* 50.37±15.95* 61.96±12.84*# 60.97±8.65*UVB阳性对照组 48.86±11.33* 59.34±27.96* 78.35±10.31* 70.67±9.41*空白对照组 35.29±8.37 36.23±9.89 38.32±8.64 38.85±11.31

4 讨 论

紫外线是伤害性光线的一种，是引起皮肤损伤的最常见因素，使皮肤松弛，粗糙，萎缩，皱纹加深加粗，色素沉着，毛细血管扩张，癌变等。光老化皮肤在组织学上的变化主要表现为表皮厚度因增生或重度萎缩明显不均一，表皮与真皮连接变平，真皮炎性细胞浸润较为多见，弹性纤维增粗、排列紊乱或聚集成团，微血管扩张并扭曲，周围常有炎性细胞浸润；黑素细胞灶性增生等[3]。角质形成细胞（KC）位于皮肤的表皮层，是表皮的主要构成细胞，也是中波段紫外线（UVB）作用的靶部位，参与固有免疫应答及皮肤炎症反应。KC主要是通过释放细胞因子而间接地影响机体的免疫功能，UV照射可使KC的IL-1、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10等基因表达及分泌增多， IL-15基因表达及分泌减少，导致皮肤免疫抑制[4，5，6]。现代实验研究证实，人永生化角质形成细胞株（HaCaT细胞）经UVB照射后，IL-10、TNF-α、IL-1β等细胞因子的分泌量明显增加。

根据中医辨证论治原则，笔者选取临床常用的清热除湿、凉血解毒药物，组成光敏汤Ⅰ号。方中白茅根清热解毒、利尿；生石膏清热生津，止渴，生地、丹皮、紫草入血分，能清热凉血，金银花、连翘、大青叶清热解毒，疏散风热，善治上焦之风热邪气；藿香、佩兰芳香化湿，内能化湿，外能解表，薏苡仁健脾、利水渗湿，渗利中焦之湿热邪气；滑石、车前子利尿通淋，使湿热之邪从小便而解；竹叶清心利尿，除心烦，小便黄；乌梅酸能敛阴生津，防风既能祛风解表，又能祛风湿，可去除皮肤肌表风湿之邪气。本方药物配伍，使上中下三焦各有出路，气血并治，内外兼顾，祛邪与扶正兼顾。光敏汤Ⅱ号在光敏汤Ⅰ号基础上加入黄芪、枸杞子、甘草。黄芪补气，能够增强机体对外界刺激的抵抗力，枸杞养肝滋阴，两药与清热除湿、凉血药配伍使用，既能祛邪，又不伤正。现代药理实验证实，枸杞子的有效成分枸杞多糖具有抗紫外线，提高免疫力的作用[7]；而黄芪总苷也被证实具有抗皮肤衰老，抗氧[8]；甘草补气、调和诸药，同时具有抗炎、类激素样作用[9]，是治疗日光性皮炎的常用药物。

从光敏汤对HaCaT细胞分泌IL-10的影响角度阐释光敏汤治疗光敏性皮炎的机制，可为进一步的研究奠定基础。

[1] 匡德芳，谷朝霞.清热除湿汤治疗日光性皮炎15例疗效观察[J].牡丹江医学院学报，2001，22（3）：66.

[2] 郝秀霞，徐伟.清热利湿法治疗多形性光敏疹[J].内蒙古中医药，2003，24（3）：8.

[3] 刘仲荣.皮肤光老化的诊断[J].国外医学皮肤性病学分册，2008，26（3）：138-140.

[4] Amerio P，Toto P，Felieiani C，et al.Rethinking the role Of tumour Necrosis factoralpha in ultraviolet（UV）B-induced immunosuppression：altered immune response in UV-irradiated TNFRIR2 genetargeted mutant mice[J].Br J Dermatol，2001，144（5）：952-957.

[5] 李海英.紫外线照射HaCaT细胞起源的细胞因子与Thl/Th2失衡的相关性研究[D].昆明医学院，2005.

[6] Artukovic M，Ikic M，Kustelega J，et al.Influence of UV radiation on immunological system and occurrence of autoimmune disease[J].Coll Antropol，2010，34：175-178.

[7]李红光. 枸杞多糖在UVB辐射人角质形成细胞氧化损伤中的保护作用[D].山西医科大学，2014.

[8]刘晓丹. 黄芪总苷有效成分和三七总皂苷有效成分配伍抗PC12细胞氧化损伤作用的研究[D].湖南中医药大学，2012.

[9]陈东波，曾繁涛. 甘草黄酮对紫外线照射无毛小鼠皮肤的防护作用[J].宜春学院学报，2014，36（6）：17-19.