老年患者感染鲍曼不动杆菌耐药性变迁机制

刘 英 李红松 王丽娜 刘金霞 郭亚春

(承德医学院，河北 承德 067000)

老年患者感染鲍曼不动杆菌耐药性变迁机制

刘 英 李红松1王丽娜 刘金霞 郭亚春

(承德医学院，河北 承德 067000)

目的 通过分析鲍曼不动杆菌的感染特征、耐药性及其产碳青霉烯酶的类型，探讨其对亚胺培南类抗生素的耐药机制。方法 收集该院对碳青霉烯类药物敏感、中介或耐药的鲍曼不动杆菌株162株，用琼脂纸片扩散法(K-B法)及肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)，用聚合酶链反应(PCR)检测其耐药基因。结果 60株耐药细菌均为多重耐药株，PCR检出47株携带OXA-23基因，3株携带OXA-24基因，85株敏感株均未检出OXA-23及OXA-24基因，各年份与2008年对亚胺培南类药物敏感性以及耐药基因OXA-23基因携带率比较有统计学差异(P<0.05)。结论 携带OXA-23和OXA-24碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用亚胺培南类抗生素的耐药率明显增高，且伴随用药时间延长呈逐年上升趋势。

鲍曼不动杆菌；碳青霉烯酶；耐药基因

鲍曼不动杆菌(AB)是医院感染常见病原菌，广泛存在于自然界、人体皮肤等环境中，是医院感染主要的条件致病菌之一，常引起医院获得性肺炎、败血症、尿道感染、伤口感染；特别是免疫受损、术后患者以及老年患者的原发感染或继发感染，病原体种类多见于革兰阴性杆菌中的鲍曼不动杆菌。抗菌谱较广的碳青霉烯类抗生素，杀菌活性强，常作为治疗革兰阴性菌感染的最强有力的药物，是免疫功能低下重症感染的老年患者的首选药物。然而，随着临床碳青霉烯类抗生素的长时间广泛应用，鲍曼不动杆菌对其出现耐药性，且呈现逐年增多趋势〔1〕。本研究就我院碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学及耐药机制进行初步分析。

1 材料和方法

1.1 一般资料 收集2008～2013年我院收治60岁以上所有发生院内感染的患者临床标本共648份。诊断依据2001年卫生部颁布的医院内感染诊断标准〔2〕。

1.2 菌株来源 分别培养648例发生院内感染的老年患者不同感染部位的组织标本、血液标本和感染部位分泌物标本，共获得162株鲍曼不动杆菌菌株，确认发生鲍曼不动杆菌感染，呼吸道感染占70.99%，尿路感染占0.62%，伤口创面感染占20.37%，导管相关血流感染占0.62%，败血症患者占1.85%。

1.3 细菌鉴定 所有标本培养方法均按全国操作规程完成，细菌分离培养后均应用VII'EK全自动微生物分析仪(法国梅里埃公司)进行鉴定。同一患者同一部位相同菌种标本，收集时间在5 d内为同一菌株，不重复进行统计。

1.4 抗菌药物选择和药敏试验 采用标准K-B纸片扩散法，药敏纸片购自中国药品生物制品检定所，操作及结果判断按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2010年版标准〔3〕。选择阿米卡星、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、妥布霉素、替卡西林/克拉维酸等16种抗生素。

1.5 耐药基因检测 PCR扩增OXA-23及OXA-24基因〔4〕。①采用酚、氯仿抽提法提取鲍曼不动杆菌DNA，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析DNA制品质量。②PCR 扩增反应体系：2×Taq PCR MasterMix 10 μl，正、反义引物(10 pmol/L)各1 μl，模板1 μl，dsH2O 7 μl。OXA-23及OXA-24基因扩增的循环参数：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，42℃ 45 s，72℃ 1 min，循环30次；最后72℃延伸8 min。③1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。所用试剂购于北京天根生化科技公司。OXA-23基因引物：正义5′-GATGTGTCATAGTATTCGTCG-3′，反义5′-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3′，产物长度1 067 bp；OXA-24基因引物：正义5′-ATGAAAAAATTTATACTTCCTATATTCAGC-3′，反义5′-TTAAATGATTCCAAGATTTTCTAGC-3′，产物长度825 bp。引物合成由上海生工公司完成。

1.6 统计学处理 采用SAS8.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1 162株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌来源及逐年耐药情况 对鲍曼不动杆菌感染部位分析，在痰液〔115株(70.99%)〕和伤口分泌物〔33例(20.37%)〕中检出率较高，与血液标本〔3例(1.85%)〕、尿液〔(1例(0.62%)〕、脑脊液〔6例(3.70%)〕、胸水〔2例(1.23%)〕、胆汁〔1例(0.62%)〕、引流液〔1例(0.62%)〕总和比较，存在统计学差异(χ2=57.09，P<0.01)。162株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的敏感性随着给药时间逐年递增，敏感性呈下降趋势，在2008年为97.2%，到2013年降至40%，二者比较有极显著性差异(χ2=13.94，P<0.01)，但2008年与2009年比较没有统计学差异(P>0.05)，见表1。

2.2 鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药基因检测 选择60株对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌菌株，分别利用PCR技术检测OXA-23和OXA-24基因，发现47株鲍曼不动杆菌中耐药基因OXA-23阳性，3株鲍曼不动杆菌OXA-24基因阳性；且随着亚胺培南类抗生素应用时间延长，耐药基因OXA-23阳性率逐年上升，与2008年的统计结果有统计学差异(P<0.05)，但OXA-24基因的分布没有统计学意义，见表2。85株敏感株均未检出OXA-23及OXA-24基因，17株中度敏感菌株未行基因检测。

表1 鲍曼不动杆菌对亚胺培南敏感情况〔n(%)〕

与2008年比较：1)P<0.05；2)P<0.01

表2 鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药基因OXA-23和OXA-24的分布情况〔n(%)〕

3 讨 论

鲍曼不动杆菌是一类不发酵糖类、氧化酶阴性、没有动力的革兰阴性细菌，能够在医院环境中长期生存，在机体抵抗力下降或免疫功能受损时易引起各种感染，包括肺炎、皮肤、尿路感染，特别是插管相关感染甚至败血症等，是目前引起医院内感染的常见重要病原菌。随着抗生素广泛应用，鲍曼不动杆菌对临床常用药物的耐药性正在逐年上升，甚至对碳青霉烯类抗生素高耐药。据文献报道鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药的主要分子机制有〔5〕：①产生碳青霉烯酶；②细菌外膜蛋白通透性降低和主动外排泵系统的亢进使细菌内有效药物浓度减少；③青霉素结合蛋白改变导致与药物亲和力降低等。其中，产碳青霉烯酶是其主要耐药机制，其碳青霉烯酶分为A、B、D 三类，D 类碳青霉烯酶按同源性可分为2 组：第1 组包括OXA-23 和OXA-27，它们只差2 个氨基酸，同源性达99%；第2 组包括OXA-24，OXA-25，OXA-26，同源性98%，两组之间的同源性仅为60%〔6〕。王辉等〔7〕报道国内耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌80%产OXA-23 型碳青霉烯酶，使临床上耐碳青霉烯类药物的不动杆菌的治疗十分困难。

本研究发现下呼吸道、皮肤和尿路感染比较多见，且对亚胺培南的耐药性呈现逐年上升趋势，耐药性形成与OXA-23，OXA-24基因密切相关。经过对耐药菌株和部分敏感菌株的OXA型碳青霉烯酶属丝氨酸蛋白酶OXA-23和OXA-24基因进行检测，发现在耐药菌株携带率较高，在敏感菌株几乎没有携带，与周敏等〔8〕研究结果报道相似。耐药基因 OXA-23位于CRAB质粒上，容易发生直接播散或通过整合子进行水平传播；OXA-24位于细菌染色体上，只能发生克隆株的水平传播，即通过病人或器械相互接触传播，需要引起临床医生关注。在临床中除对药物应用进行监管，并做到合理应用外，还需对呼吸机做到合理应用及严格消毒，减少耐药菌的出现和扩散。严格消毒隔离措施、手卫生及抗生素的合理应用是控制多重耐药鲍曼不动杆菌的关键环节。

1 李 春.鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药机制研究进展〔J〕.国外医药·抗生素分册，2009；30(2)：54-6.

2 中华人民共和国卫生部医院感染诊断标准(试行)〔J〕.中华医学杂志，2001；81(5)：314-20.

3 Chang CJ，Ye JJ，Yang CC，etal.Influence of third-generation cephalosporin resistance on adult in-hospital mortality from post-neurosurgical bacterial meningitis〔J〕.J Microbiol Immunol Infect，2010;43(4)：301-9.

4 Fu Y，Zhou J，Zhou H，etal.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China〔J〕.J Antimicrob Chemother，2010;65(4)：644-50.

5 Fernandez-Cuenca F，Martinez Martinez L，Conejo MC，etal.Relationship between beta-lactamase production，outermembrane protein and penicillin-binding protein profileson the activity of carbapenems against clinical isolates ofAcinetobacter baumannii 〔J〕.Antimicrob Chemother，2003；51(3)：565-74.

6 Turton JF，Woodford N，Glover J，etal.Identification of Acinetobacter baumannii by detection of the bla OXA-51-like carbapenemase gene intrinsic to this species〔J〕.J Clin Microbiol，2006;44(7)：2974-9.

7 王 辉，孙宏莉，廖 康，等.北京和广州地区四家医院不动杆菌碳青霉烯酶基因型研究〔J〕.中华检验医学杂志，2005;28(6)：636-7.

8 周 敏，黄 茂，梅亚宁.鲍曼不动杆菌OXA-23 型碳青霉烯酶相关耐药基因分析〔J〕.南京医科大学学报，2009；29(8)：1142-3.

〔2014-09-17修回〕

(编辑 李相军)

河北省科技计划项目(11276103D-62)

刘金霞(1969-)，女，主任医师，博士，硕士生导师，主要从事病原生物学研究。 李红松(1971-)，女，主治医师，主要从事病原生物学研究。

刘 英(1983-)，男，在读硕士，主要从事细菌学研究。

R181.3

A

1005-9202(2015)12-3375-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.088

1 承德市双桥区卫生监督所