电针在骨骼肌修复中对I型胶原蛋白的影响

赵星宇 李冬松 王云亭 王荣国

(吉林大学第一医院骨关节外科，吉林 长春 130021)

电针在骨骼肌修复中对I型胶原蛋白的影响

赵星宇 李冬松 王云亭1王荣国2

(吉林大学第一医院骨关节外科，吉林 长春 130021)

目的 通过Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ)表达的时程变化规律观察骨骼肌修复过程中电针防止过度纤维化的作用。方法 使用60只新西兰兔建立腓肠肌急性钝挫伤模型后，随机分为模型对照组(A组)；电针阿是穴组(B组)；电针足三里组(C组)；电针阿是穴+足三里组(D组)。于制模后7、14、28 d取材，通过免疫组化技术检测组织中collagen-Ⅰ在骨骼肌修复过程中的表达水平。结果 急性骨骼肌钝挫伤后7 d，电针组与A组中collagen-Ⅰ表达无明显差异；急性骨骼肌钝挫伤后14 d，各组collagen-Ⅰ表达持续增加，但电针组collagen-Ⅰ表达的上升幅度显著低于A组(P<0.05)；急性骨骼肌钝挫伤后28 d，电针组中collagen-Ⅰ表达呈下降趋势，而A组中collagen-Ⅰ表达继续增加(P<0.05)。结论 (1)电针治疗能通过降低collagen-Ⅰ的表达水平，抑制骨骼肌的过度纤维化，防止瘢痕的形成，有利于损伤骨骼肌的修复；(2)电针刺激阿是穴+足三里的疗效优于单独选用阿是穴或足三里，两穴具有协同作用。

电针；骨骼肌；钝器伤；波形蛋白；Ⅰ型胶原蛋白

治疗骨骼肌损伤的目的在于促进骨骼肌纤维再生并同时抑制细胞外基质过度纤维化，防止瘢痕的形成，尽可能使损伤骨骼肌恢复正常收缩功能。研究证实电针有预防伤口纤维化粘连的作用〔1〕。肌纤维中Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ)作为组织纤维化的主要标志物，已在对各脏器纤维化疾病的研究中得到证实〔2，3〕。本研究对急性骨骼肌钝挫伤动物模型应用电针进行治疗，通过观察collagen-Ⅰ的表达水平，探讨电针对防治过度 纤维化的作用。

1 材料及方法

1.1 对象 健康成年新西兰兔60只，雌雄不限，体重(2.0±0.2)kg，北京海淀兴旺动物养殖场〔SCXK(京)2011-0010〕提供，于中国中医科学院基础理论研究所动物室普通环境饲养〔SYXK(京)2010-0032〕。随机分为模型对照组(A组，n=15)：模拟电针治疗组固定；电针阿是穴组(B组，n=15)；电针足三里组(C组，n=15)；电针阿是穴+足三里组(D组，n=15)。

1.2 主要仪器及试剂 韩氏穴位神经刺激仪(HANS200E，南京济生)；骨骼肌急性钝挫伤砸伤器(中国中医科学院望京医院)；图像分析软件(Image-Pro Plus Version 6.0，美国Media Cybernetics)； collagen-Ⅰ兔多克隆抗体(lot:No 9A79C，武汉博士德)，vimentin鼠单克隆抗体(lot:E2611，美国SANTA CRUZ)； SV-002-兔IgG(lot：07B21CJ，武汉博士德)，SV-001-鼠IgG(lot：06J26CJ，武汉博士德)。

1.3 方法

1.3.1 建立动物模型 所有动物在实验前1 d双侧小腿剃毛、称重、禁食；3%戊巴比妥钠30 mg/kg体重耳缘静脉注射麻醉，将动物右侧在上侧卧位固定于造模台，右后肢置于伸膝、踝背屈约90°固定，便于腓肠肌显示。在腓肠肌距跟骨后缘8 cm处标记打击位置，用砸伤器造成一次性钝挫伤，打击面积为1 cm2，能量为9.75 J。打击处皮肤完整，胫腓骨无骨折。放回笼中，家兔麻醉苏醒后自由活动。所有动物在麻醉、术前、术后的喂养、室温及其他管理条件一致。通过解剖和病理证实急性钝挫伤模型制作成功。

1.3.2 干预方法 创面常规处理：外用25 g/L安尔碘处理，1次/d，保持干燥避免感染。电针各组在创面常规处理的基础上，于造模后24 h开始电针治疗。用兔固定器固定动物后，将双后肢伸出，取左后肢“足三里(ST36)”穴(参照《中国兽医针灸学》)，主针刺入穴位区15 mm，辅针在旁开5 mm处刺入皮下。阿是穴分别取距打击部位远、近端各10 mm处，针刺入穴区15 mm，针刺后接电针仪。电针参数：频率2 Hz，0.4 mA，时间15 min，隔日1次，直到取材前1 d结束治疗。所有电极同步刺激，参数一致。A组进行模拟固定，但不进行电针刺激。

1.3.3 取材及标本处理 于造模后7、14、28 d，从各组分别取5只动物，麻醉后切开小腿后侧皮肤，暴露腓肠肌于造模部位取材。取造模区骨骼肌组织10×10×3 mm3，4%多聚甲醛固定3 d，脱水、透明、浸蜡、包埋，5 μm切片行免疫组化染色。于A组健侧腓肠肌对应部位取材作为正常空白对照。

1.3.4 指标和方法 采用两步法免疫组化检测：切片脱蜡至水；3%H2O2，室温10 min，蒸馏水洗2 min×3次；滴加封闭液，室温10 min；甩去多余液体，不洗；滴加一抗(浓度1∶50)，4℃过夜；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；滴加聚合HRP标记抗兔IgG(SV-002)，37℃孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；DAB显色：取1 ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色10 min；蒸馏水洗涤；脱水，透明，封片。

1.4 实验结果分析 免疫组化切片分别在物镜下随机选取6个视野采集图像，输入Image-Pro Plus Version 6.0图像分析软件，胞质染成棕黄色为阳性，分析其平均光密度值(OD)。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析和非参数检验。

2 结 果

骨骼肌损伤后7 d，A组与各电针组中collagen-Ⅰ均有所表达，与正常空白对照相比差异显著(P<0.05)，各电针组与A组相比无显著差异(P>0.05)。骨骼肌损伤后14 d，A组与各电针组中collagen-Ⅰ表达继续增加，各电针组与A组相比，上升幅度显著低于A组(P<0.05)；B组及C组collagen-Ⅰ表达强度明显高于D组(P<0.05)；C组表达强度高于B组，但差异无统计学意义。骨骼肌损伤后28 d，A组与各电针组中collagen-Ⅰ表达继续增加，电针组collagen-Ⅰ表达则呈下降趋势；B组及C组collagen-Ⅰ表达强度明显高于D组(P<0.05)；C组表达强度高于B组，但差异无统计学意义。见表1，图1。

表1 7、14、28 d各组家兔腓肠肌collagen-Ⅰ的OD值

与正常空白对照组比较：1)P<0.05；与A组比较：2)P<0.05；与D组比较：3)P<0.05

图1 7、14、28 d各组家兔腓肠肌collagen-Ⅰ的表达(DAB，×40)

3 讨 论

本研究选用成熟的、单次致伤的腓肠肌急性钝挫伤模型，可以最大程度地模拟临床损伤过程。9.75 J的致伤能量经预实验证实造模成功，没有引起骨折。致伤能量可以精确控制，具有可重复性，模型稳定。组织修复可分再生和瘢痕修复，再生是由损伤周围的同种细胞来修复；瘢痕修复是再生能力弱或缺乏的组织，发生缺损后，只能由肉芽组织填补，由纤维结缔组织修复，而后形成瘢痕，不能通过原来组织再生修复。修复过程中，肌纤维再生和瘢痕组织相互依赖、相互竞争，两者的平衡是损伤骨骼肌恢复正常收缩功能的前提。经自然愈合的严重的骨骼肌损伤难以完全恢复到未损伤前的功能状态，瘢痕的形成会阻碍肌纤维再生，影响肢体功能，引起后遗疼痛并增加再次损伤的概率。因而，提高骨骼肌损伤后功能恢复的研究主要应放在如何抑制ECM过度纤维化这个方面。

针灸可纠正腧穴处气血流动的失衡，进而达到治疗疾病并促进伤口愈合的目的。其作为特殊的中医外治手段，通过电疗技术刺激穴位，调节经络气血，增强机体防御能力，以促进机体功能恢复，具有治疗安全、操作简单、仪器轻便、可在各层医疗机构得到推广的优势。阿是穴是病痛局部的反应点，是经络气血在病理情况下一时聚留之处〔4〕。有研究证实，在阿是穴针刺后Na，K-ATP酶活性得到增加〔5〕，在一定程度上可修复细胞内Ca2+的正常代谢〔6〕，并改善局部血流情况，从而修复超微结构的损伤变化，达到治疗骨骼肌损伤的目的。

足三里是补益气血的大穴，解剖位置位于胫骨前肌上。吴立红等〔7〕发现电刺激足三里可以对抗大鼠运动性疲劳，其机制可能是通过改善大鼠整体健康状况，提高能量代谢效率，纠正自由基代谢失衡，减少代谢产物的堆积，从而达到治疗目的。

电针的刺激参数和电流强度是影响疗效的重要因素。在前期实验〔8〕中我们发现运用0.2 mA和0.4 mA电流电针足三里+阿是穴均有减少胶原纤维在创面所占比例和增加肌纤维面积的作用，并且0.4 mA的效果更好，0.6 mA对创区可能存在二次损害效应。关于观察时间点的选择，我们考虑：肌肉再生是从损伤后的2～3 d开始，到2 w达到高峰，并在随后减弱；瘢痕组织即纤维化的形成是在损伤后的2～3 w，并随着时间的推移而增大〔9〕。7 d是炎症反应和再生均存在的一个时间点，便于观察治疗的早期效果；14 d是纤维化进行活跃的时期，便于观察纤维化的进展；28 d是修复的结局，便于观察修复结果。

collagen主要由成纤维细胞及上皮细胞分泌，到目前为止，已有28种主要类型的collagen被确认，它们是骨、软骨、肌腱、皮肤及肌肉的重要组成部分〔10〕。collagen的生物相容性和促进伤口愈合的能力使collagen在伤口愈合中扮演重要角色〔11〕。但我们同时发现在严重的肌肉创伤中，成纤维细胞的大量增生将会导致过度纤维化，坚韧的瘢痕组织的大量形成，借助机械屏障阻碍SC迁移到损伤区域，并提供不适当的细胞分化信号，从而阻碍骨骼肌的再生〔12〕。collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ是骨骼肌中的主要胶原〔13〕，在骨骼肌损伤后修复过程中，早期形成的肉芽组织中富含collagen-Ⅲ，collagen-Ⅰ的量很少，其弹性很好而张力差；后期的疤痕组织中则以collagen-Ⅰ为主，张力好但弹性很差〔14〕。所以，我们有理由相信在这种胶原蛋白代谢失衡、基质重构的过程中，collagen-Ⅰ的过度沉积是导致骨骼肌瘢痕形成的主要原因。我们的实验结果说明，在骨骼肌修复早期collagen-Ⅰ积极参与骨骼肌的再生，为骨骼肌正常形态和功能的恢复提供支架与桥梁，电针治疗并没有明显抑制其表达，这与Thais等〔12〕的观点是相似的，他们认为在骨骼肌修复的早期，低功率激光加速肌肉的修复正是通过提高肌细胞的增殖并促进collagen的合成来完成的。而骨骼肌损伤14 d时电针已开始对ECM的纤维化进行抑制。28 d，电针治疗能降低collagen-Ⅰ的过度沉积，抑制损伤骨骼肌中ECM的过度纤维化，有效防止了瘢痕形成。

综上所述，我们认为电针治疗能通过降低collagen-Ⅰ的表达水平，抑制骨骼肌的过度纤维化，防止瘢痕的形成，有利于损伤骨骼肌的修复；电针刺激阿是穴+足三里的疗效优于单独选用阿是穴或足三里，两穴具有协同作用。

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〔2014-12-25修回〕

(编辑 郭 菁)

The effect of electroacupuncture influencing vimentin and collagen-Ⅰ in skeletal muscle repair

ZHAO Xing-Yu,LI Dong-Song,WANG Yun-Ting,etal.

The First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To investigate the roles of electroacupuncture in prevention of excessive fibrosis of the skeletal muscle.Methods The acute skeletal muscle contusion model was produced at the gastrocnemius by specific device;all rabbits were divided into model control group(group A);electroacupuncture stimulation ouch point group(group B);electroacupuncture stimulation tsusanli group(group C);electroacupuncture stimulation ouch point and tsusanli group(group D). At 7,14,28th day after injury,and the expressions of vimentin and collagen-Ⅰwere tested by immunohistochemistry.Results At 7th day after injury,the expression of collagen-Ⅰ were no significant differences between the electroacupuncture groups and group A;at 14th day after injury,the expression of collagen-Ⅰ were increased continually in each group,but the rises of the expression of collagen-Ⅰ in the electroacupuncture groups were significantly lower than that of group A,P<0.05;At 28th days after injury,the expression of collagen-Ⅰ in the electroacupuncture groups were showing a decreasing trend,but the expression of collagen-Ⅰ in group A was increased continually,P<0.05，group B> group C>group D.Conclusions The electroacupuncture treatment could inhibit excessive fibrosis of skeletal muscle to prevent scar formation by reducing the expression of collagen-Ⅰ,which is beneficial to skeletal muscle repair. The curative effect of combined tsusanli and ouch point group is better than tsusanli or ouch point group separately,the two points have a synergistic effect.

Electroacupuncture;Skeletal muscle;Contusion injury;Collagen-Ⅰ

国家自然科学基金资助项目(81173343)

王云亭(1965-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事手外疾病、四肢软组织缺损的修复与重建研究。

赵星宇(1986-)，男，医师，主要从事骨关节科常见病及多发病的诊断与治疗研究。

R68

A

1005-9202(2015)12-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.002

1 中日友好医院 2 北京中医药大学