自噬相关基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠海马中的表达及意义

周风华 刘焕彩 陈燕春 鞠 杰 蒲雷东 王巧真 接琳琳 丁昊宇

(潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊 261053)

自噬相关基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠海马中的表达及意义

周风华 刘焕彩1陈燕春2鞠 杰2蒲雷东2王巧真2接琳琳2丁昊宇2

(潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊 261053)

目的 观察自噬相关基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因鼠海马组织中的表达变化，探讨细胞自噬机制在ALS发病中的作用及意义。方法 选择SOD1-G93A转基因鼠进行试验，分别于发病早、中、晚期，通过RT-PCR、免疫荧光检测小鼠海马组织中Atg4B、LC3-Ⅱ在mRNA、蛋白水平的表达及变化。结果 与野生型鼠相比较，转基因鼠的Atg4B在mRNA及蛋白水平表达均下调；LC3-Ⅱ在蛋白水平表达上调，在mRNA水平变化不明显。结论 自噬相关基因Atg4B及LC3-Ⅱ参与了ALS发病，ALS海马组织的病变与自噬异常有关。

自噬；ALS；Atg4B；LC3-Ⅱ

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种选择性上、下运动神经元进行性变性为主要特征的神经退行性疾病，临床主要表现为进行性全身肌肉无力，多数患者在发病3～5年内死于呼吸衰竭〔1〕。除运动系统功能障碍外，部分ALS患者可出现明显的认知功能等行为学损害〔2〕因而ALS的发展可能与海马结构有关〔3〕。细胞自噬是真核细胞特有的生命现象〔4〕，参与人体的多种生理及病理过程。Atg4B及LC3-Ⅱ是两个重要的自噬相关基因，参与了自噬体的形成。Morimoto等〔5〕研究发现，ALS的发病与细胞自噬有关，而自噬基因Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS海马中的表达变化及作用尚无明确报道。本实验通过检测Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS转基因鼠海马组织中的表达变化，探讨细胞自噬在ALS发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型及标本处理 野生型及突变型SOD1-G93A转基因小鼠购自美国Jackson Laboratories。该动物模型携带有突变的SOD1基因，能够模拟人类ALS的疾病进展及临床表现，是研究ALS疾病的理想动物模型。严格按转基因鼠饲养条件进行饲养，成年鼠按雌雄比1∶1进行合笼，出生后的小鼠约30 d后，提取鼠尾DNA，基因扩增进行野生型及突变型小鼠鉴定。选取突变型成年鼠18只，随机分为发病早期(生后约95 d)、发病中期(出生后约108 d)、发病晚期(出生后约122 d)。每个时间点选3只鼠进行4%多聚甲醛灌注固定，剥离大脑，30%蔗糖脱水，冰冻切片，进行免疫荧光检测；每个时间点选3只鼠拉颈处死，剥离海马，提取总RNA并反转录合成cDNA，进行RT-PCR检测；以相同数量的同窝野生型鼠作为对照组。

1.2 主要试剂 兔抗多克隆抗体Atg4B，anbo公司；LC3-Ⅱ，Abcam公司；Cy3标记的羊抗兔IgG，美国Jackson Immuno Research Laboratoris；RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司；OligdT，美国Promega公司；5×逆转录Buffer，美国Promega公司；M-MlV逆转录酶，美国Promega公司。

1.3 免疫荧光标记 将冰冻切片室温晾片2 h，滴加10%山羊血清，37℃封闭40 min，分别滴加兔抗多克隆抗体Atg4B、LC3-Ⅱ(浓度均为1∶100)，4℃孵育过夜，滴加Cy3标记的羊抗兔IgG荧光二抗(浓度为1∶400)，避光37℃孵育30 min，滴加终浓度为10 μg/ml的Hoechst33258，避光37℃孵育15 min，防淬灭荧光封片剂封片，用荧光显微镜观察Atg4B及LC3-Ⅱ表达情况。实验过程中的冲洗缓冲液均为0.01 mol/L的PBS缓冲液。

1.4 RT-PCR (1)总RNA的提取:取大脑海马组织，加入500 μl TRIzol，冰上充分匀浆，具体步骤参照文献〔6〕。(2)逆转录反应。(3)PCR扩增反应：Atg4B上游引物：5′TACAGCATTTTCACAGAGAAGGACG 3′，Atg4B下游引物：5′CTCCAGCAGGGAACCCATTAC3′。LC3-Ⅱ上游引物：5′CCCAGTGATTATAGAGCGATACAAG3′，LC3-Ⅱ下游引物：5′TGTCTCCTGCGAGGCATAAAC3′。以1 μl逆转录产物为模板，2×Taq PCR Mastermix 10 μl。Atg4B、LC3-Ⅱ上下游引物分别各0.5 μl，β-actin上游引物、下游引物各0.3 μl，分别组成PCR反应体系。PCR仪中运行以下程序：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次，72℃延伸5 min后冷却至4℃。

1.5 统计学处理 应用IPP5.1图像分析软件进行统计学分析。测量Atg4B及LC3-Ⅱ免疫荧光图片阳性细胞累积光密度(IOD)值。测量RT-PCR显示的mRNA扩增带与β-actin扩增带的IOD值。用SPSS20.0软件行独立样本t检验。

2 结 果

2.1 Atg4B在海马组织中的表达 免疫荧光检测显示，在野生型及突变型小鼠海马组织中，均检测到Atg4B阳性细胞，阳性细胞主要分布在海马的DG区，CA可见少量阳性细胞。与野生型小鼠比较，在发病的早期，突变型小鼠Atg4B阳性细胞累积光密度变化不明显，而在发病中、晚期，突变型小鼠Atg4B阳性细胞累积光密度在DG区明显降低(68.5±5.2 vs 32.3±2.6,P<0.05)，CA区阳性细胞累积光密度变化不明显(P>0.05)。RT-PCR结果显示，与野生型小鼠比较，在发病的早(61.2±5.7 vs 58.2±7.2)、中(60.1±5.2 vs 38.5±4.7)、晚期(59.5±4.2 vs 39.7±3.5)，突变型小鼠Atg4B mRNA水平明显下调(P<0.05)，见图1，图2。

图1 Atg4B在突变型小鼠122 d海马组织中的表达(标尺=50 μm)

图2 Atg4B在突变型小鼠发病早、中、晚期mRNA表达变化

图3 LC3-Ⅱ在突变型小鼠122 d海马组织中的表达(标尺=50 μm)

图4 LC3-Ⅱ在突变型小鼠发病早、中、晚期mRNA表达变化

2.2 LC3-Ⅱ在海马组织中的表达呈上调趋势 免疫荧光检测显示，在野生型及突变型小鼠海马组织中，均检测到LC3-Ⅱ阳性细胞，阳性细胞主要分布在海马的DG区。与野生型小鼠比较，在发病的早期，突变型鼠LC3-Ⅱ阳性细胞累积光密度变化不明显，在发病的中、晚期，突变型鼠LC3-Ⅱ阳性细胞累积光密度明显增加(62.5±6.1 vs 35.3±4.5,P<0.05)。RT-PCR结果显示，与野生型小鼠比较，在发病的早(36.5±4.2 vvs 34.1±5.3)、中(38.3±5.1 vs 39.1±4.3)、晚期(40.5±5.6 vs 39.8±4.2)，突变型小鼠LC3-Ⅱ mRNA水平变化不明显(P>0.05)，见图3，图4。

3 讨 论

自噬是真核细胞特有的生命现象〔4〕，参与人体的多种生理及病理过程。有研究报道，自噬与阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿舞蹈病(HD)和帕金森病(PD)等多种神经退行性疾病有关〔6〕。在这些神经退行性疾病中，自噬可能通过清除异常折叠的蛋白而延缓疾病的进展。尸体剖验及动物实验均证实在ALS脊髓组织中自噬小体的数量增加〔5〕，提示在ALS发病中自噬被激活，但目前自噬的激活机制及意义尚未完全阐明。

微管相关蛋白轻链3(LC3)是哺乳动物细胞中酵母8(Atg8)基因的同源物，参与细胞的自噬过程。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，当自噬尚未发生时，LC3以可溶性的LC3-Ⅰ存在，当自噬发生时，LC3与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)结合，转化成脂溶性的LC3-Ⅱ〔7〕。LC3-Ⅱ的含量多少与自噬泡的数量成正比，因此LC3-Ⅱ的表达强度与自噬活性密切相关，是自噬检测的标记〔8〕。LC3-Ⅱ与多种神经退行性疾病有关，在AD转基因鼠及β-淀粉样蛋白作用的原代皮质神经元中LC3-Ⅱ表达上调。而亨廷顿蛋白的突变导致了骨骼肌中LC3-Ⅱ的合成增加〔9〕。Morimoto等〔5〕研究发现，在ALS发病期，LC3-Ⅱ在SOD1G93A转基因小鼠模型脊髓中是上调的，表明LC3-Ⅱ诱导的自噬激活可能参与了ALS发病。我们的实验结果显示，在ALS发病期，海马组织中LC3-Ⅱ在mRNA及蛋白水平均明显上调，由此提示，ALS海马组织的病变与自噬异常有关。最近，一个大规模的蛋白质组学实验揭示在人自噬过程中，LC3-Ⅱ和它的直系同源物组成了约67种蛋白的网络〔10〕。而LC3-Ⅱ调控自噬途径的机制可能与蛋白质之间的相互作用有关。Atg4是一种半胱氨酸蛋白激酶，能够可逆性的催化LC3形成脂质化及去脂质化LC3。在哺乳动物中，有四种Atg4的同系物，包括Atg4A、Atg4B、Atg4C及 autophagin-4，其中Atg4B对LC3-Ⅱ有明显的特异性及高效性。研究发现，非活化Atg4B的高表达可以通过抑制LC3-I的脂质化而明显抑制自噬体的形成〔11〕，由此提示，Atg4B和LC3通过之间的相互作用参与了细胞的自噬过程。目前，在ALS发病中Atg4B和LC3-Ⅱ是否参与了海马组织病变尚未见报道。我们的研究结果显示，Atg4B和LC3-Ⅱ均主要在海马组织的DG区表达，但是表达趋势相反，在ALS发病期，海马组织中Atg4B的表达下调，而LC3-Ⅱ的表达明显上调，提示Atg4B和LC3-Ⅱ在ALS发病期海马组织的病变中发挥了作用，而且两者之间还可能通过一定的调控机制共同参与其中。同时，我们还发现，在ALS转基因鼠的海马组织中，自噬相关基因LC3-Ⅱ在蛋白水平明显上调，但是在mRNA水平变化并不明显，因此，LC3-Ⅱ在蛋白水平的表达可能存在更复杂的分子机制。这些分子机制有待于我们进一步研究和探讨。

1 Renton AE，Chiò A，Traynor BJ.State of play in amyotrophic lateral sclerosis genetics〔J〕.Nat Neurosci，2014；17(1)：17-23.

2 Phukan J，Elamin M，Bede P，etal.The syndrome of cognitive impairment in amyotrophic lateral sclerosis：a population-based study〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2012；83(1)：102-8.

3 Takeda T，Uchihara T，Arai N，etal.Progression of hippocampal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis with or without memory impairment：distinction from Alzheimer disease〔J〕.Acta Neuropathol，2009；117(1)：35-44.

4 Klionsky DJ，Emr SD.Autophagy as a regμlated pathway of cellμlar degradation〔J〕.Science，2000；290(5497)：1717-21.

5 Morimoto N，Nagai M，Ohta Y，etal.Increased autophagy in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene〔J〕.Brain Res，2007；1167：112-7.

6 Kuusisto E，Salminen A，Alafuzoff I.Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies〔J〕.Neuroreport，2001；12：2085-90.

7 Bjorkoy G，Lamark T，Brech A，etal.p62/SQSTM1forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on Huntingtin-induced cell death〔J〕.J Cell Biol，2005；171：603-14.

8 Nakaso K，Yoshimoto Y，Nakano T，etal.Transcriptional activation of p62/A170/ZIP during the formation of the aggregates：possible mechanisms and the role in Lewy body formation in Parkinson′s disease〔J〕.Brain Res，2004；1012：42-51.

9 Sasaki S.Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2011；70(5)：349-59.

10 Geng J，Klionsky DJ.The Atg8 and Atg12 ubiquitin-like conjugation systems in macroautophagy.Protein modifications：beyond the usual suspects′ review series〔J〕.EMBO Rep，2008；9(9)：859-64.

11 Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，etal.LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing〔J〕.EMBO J，2000；19(21)：5720-8.

〔2014-09-19修回〕

(编辑 郭 菁)

国家自然科学基金青年基金(81401066)；山东省自然科学基金(ZR2012HQ021)；山东省教育厅课题(J11LF16，J12LK51，J13LK05)；山东省医药卫生科技发展计划项目(2013W-S0279)；潍坊市科学技术发展计划项目(201302089，2013-01074)

陈燕春(1979-)，女，副教授，博士，主要从事神经发育与神经退行性疾病相关研究。

周风华(1977-)，女，副教授，硕士，主要从事神经病理研究。

R744.8

A

1005-9202(2015)12-3216-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.013

1 潍坊医学院临床学院 2 潍坊医学院组织胚胎学教研室