重组鸭干扰素的研发及其在鸭病防治中的应用

解瑞钦 赵文东（山东大宝养殖加工有限责任公司 山东 新泰 271200）

干扰素(interferon，IFN)是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，在同种动物细胞上具有广谱抗病毒活性，除此之外还有免疫调节、抑制细胞分裂和抗肿瘤等生物学活性。根据IFN蛋白的氨基酸序列、细胞来源以及其所结合受体的不同，将其分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，I型IFN是，主要是α-干扰素和β-干扰素两种，具有抗病毒的活性，Ⅱ型IFN主要是γ-干扰素(interferon-gamma，IFN-γ)，除具有I型IFN抗病毒活性外，还具有独特的免疫调节功能和抗肿瘤作用。由于IFN-γ对机体免疫系统具有极大的调节作用，是机体发挥免疫功能，清除体内病原体不可缺少的成分，因此，IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用，是现代分子生物学，免疫学和临床医学研究的热点之一。

1 材料和方法

DNA，利用M13引物进行PCR鉴定，M13上游引物5’-CG CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，下游引物5’-AGC GGATAACAATTTCACACAGGA-3’。

1.4 重组蛋白鉴定 将重组病毒感染sf9细胞，收集感染细胞进行IFA分析，鉴定重组蛋白的表达。

1.5 重组IFN抗病毒活性分析 利用水泡性口炎病毒(VSV)－鸭胚成纤维细胞分析重组IFN的抗病毒活性，确定重组IFN的抗病毒活性单位。

2 结果

2.1 基因扩增及序列 PCR扩增DIFN-γ蛋白基因片段，取2µlPCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，可见到466bp的条带(图1)，与预期结果相符。

1.1 基因扩增及序列分析 根据已发表鸭IFN-γ序列，设计扩增一对引物，引物序列为：F：5’ATGATCTACGAAT TCCACACCGCCTCC3’；R：5’CAAGTCTGTCGACATA GCAGTTGCAGC3’。分离鸭脾淋巴细胞，刺激后，提取mRNA，进行RT-PCR扩增，将目的产物回收后，连接至pMD-18T载体，测定序列，与已发表序列进行分析。

1.2 重组Bacmid质粒构建与鉴定 将鸭IFN-γ完整开放阅读框克隆至pFastbac1载体，鉴定后，转化DH10Bac感受肽细胞，在三种抗生素的压力筛选下，获得整合鸭IFN-γ完整开放阅读框的重组Bacmid质粒。

1.3 重组杆状病毒的获得 提取高质量的重组Bacmid质粒，在脂质体介导下转染sf9细胞，盲传3代后，提取病毒

2.2 重组Bacmid质粒EcoRⅠ、SalⅠ双酶切PMDDIFN-γ，将DIFN-γ克隆至供体质粒pFastBacTM1EcoRⅠ、SalⅠ位点。将重组供体质粒转化DH5α感受态细胞，通过Amp+抗性筛选阳性克隆，碱裂解法提取质粒。重组质粒pFBac-DIFN-γ经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，消化得到约4760bp和550bp两个片段(图2)。

2.3 重组杆状病毒 从感染重组杆状病毒的细胞和培养上清中提取病毒DNA，用M13通用引物进行PCR鉴定，PCR扩增产物为2.8kb(图3)，结果表明DIFN-γ基因已通过转座被整合到重组杆状病毒基因组中，标记为rBac-DIFN-γ。

2.4 间接IFA检测IFN-γ表达 分别用感染野生型杆状病毒和rBac-DIFN-γ感染的sf9细胞制备涂片，以1:100倍稀释的兔抗原核表达DIFN-γ免疫血清为一抗，间接IFA检测重组杆状病毒表达的IFN-γ。结果显示rBac-DIFN-γ感染细胞膜上有强的荧光信号(图4A)，而以相同稀释倍数的非免疫兔血清为一抗，三种重组杆状病毒感染细胞的荧光信号则为阴性(图4B)；同样兔抗原核表达IFN-γ免疫血清为一抗，野生型杆状病毒感染细胞的荧光信号也为阴性(图4C)。结果表明：在昆虫细胞中获得表达。

图4 间接免疫荧光检测IFN-γ在昆虫细胞中的表达

图5 利用VSV*GFP－CEF系统测定DIFN-γ抗病毒活性

2.5 重组IFN抗病毒活性 利用VSV*GFP-CEF细胞病变抑制法测定重组杆状病毒表达重组DIFN-γ的抗病毒活性。以不同浓度重组DIFN-γ作用DEF细胞后，感染VSV*GFP24h后荧光显微镜观察。结果显示，未加重组DIFN-γ空白对照孔呈现大量荧光(图5D)；2×104倍稀释可以完全抑制VSV*GFP在DEF细胞上的复制，荧光信号为阴性(图5A)；而2×105和2×106倍稀释部分抑制VSV*GFP的复制，呈现少量荧光(图5B,5C)，其活性为2×105IU/ml。

3 讨论

（1）本研究构建了含有完整IFN-γ基因ORF的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达重组IFN-γ，以兔抗原核表达IFN-γ免疫血清做为一抗，通过间接IFA和间接ELISA检测其在昆虫细胞中获得表达。在间接免疫荧光试验检测IFN-γ表达时，荧光主要集中在细胞膜上，胞浆中荧光相对较少。同时，含有IFN-γ基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞的培养上清作为包被抗原，间接 ELISA能敏感、特异地与兔抗原核表达IFN-γ免疫血清中的特异性抗体反应。结果表明，重组杆状病毒表达的重组IFN-γ蛋白经过翻译后的加工与修饰作用，和天然IFN-γ一样可以进行分泌型表达。（2）传统的干扰素抗病毒活性是利用细胞病变抑制法测定，通过肉眼或显微镜观察噬斑的数量而确定其活性单位，本实验采用的重组VSV*GFP可以在感染宿主细胞内表达绿色荧光蛋白，通过观察荧光强度和数量，便可确定其感染和复制情况，因此通过测定其荧光强度和数量就可以确定干扰素的活性单位，使得干扰素活性的测定更加准确和简便。在利用细胞病变抑制法测定重组IFN-γ抗病毒活性的试验中，重组IFN-γ稀释倍数相同时，重组DIFN-γ荧光强度要明显强于其它两种干扰素，原因可能是PK-15细胞对VSV病毒更为敏感。（3）由于重组杆状病毒在昆虫细胞中表达的IFN-γ经过了更多的翻译后加工与修饰作用，因而在结构与功能上更接近于天然IFN-γ。这为进一步对IFN-γ结构与功能的研究提供了方便。同时，重组杆状病毒表达的重组IFN-γ具有高效的抗病毒活性，也为临床应用奠定了基础。

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