潍坊及周边地区牛支原体感染状况调查

孙 霞，胡士林

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊261061）

自从国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体以来［1］，我国已有湖北、湖南、贵州、安徽、新疆、吉林、江西等10多个省报道了牛场有牛支原体感染，目前，国内外还没有很好的防控方法，又因为抗菌药物的广泛使用，逐渐出现了耐药菌株［2－4］，牛支原体（Mycoplasma bovis）作为感染牛的重要病原微生物之一，如果与其他多种病原混合感染则引起病情加剧，病死率会急剧上升，给肉牛和奶牛养殖业均会造成较大的经济损失［5］。

2014年5月，对潍坊地区发生肺炎的肉牛场进行了牛支原体的分离，成功得到菌株，并进行了鉴定，证实为牛支原体。为了解潍坊及周边地区健康牛场牛支原体的自然感染情况和临床发生呼吸道症状特别是有肺炎症状牛的牛支原体感染率，采集了14个牛场的188份健康牛血清和10个发病牛场39份发生呼吸道症状牛的肺及鼻腔深部分泌物，通过间接ELISA 和套式PCR 方法对采集到的样品进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 牛支原体间接ELISA 试剂盒购自比利时Bio－X 公司；牛支原体阳性对照菌株来自中国动物卫生与流行病学中心；用于提取病料中牛支原体DNA 的试剂盒与PCR 检测的试剂耗材等均购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.1.2 检测样品来源 所用血清样品188份均来自健康奶牛和肉牛，是2014年4月～2015年4月从潍坊地区及周边地区的肉牛场和奶牛场采集获得，其中奶牛场血清样品100 份，肉牛场血清样品88份；PCR 检测所用发病牛病料39份，其中5份为发生肺炎或发生肺炎后死亡牛的肺脏，34份为有呼吸道临床症状牛的鼻腔深部分泌物。上述牛场的牛均未接种牛支原体疫苗。

1.1.3 试验用牛支原体阳性对照菌株 来自中国动物卫生与流行病学中心。

1.2 方法

1.2.1 间接ELISA 检测 按照比利时Bio－X 公司生产的牛间接ELISA 试剂盒说明书进行严格操作。

1.2.2 病料的处理与牛支原体的培养 无菌采取少量病变明显部位的肺组织或取少量的鼻腔深部分泌物，加适量PPLO 液体培养基进行匀浆，500 r／min离心10min，取上清液，通过0.45μm 孔径的滤器过滤，后置于37℃、体积分数为10%的CO2培养箱内培养72h，后进行一次传代，继续培养，每天观察培养基颜色的改变，将颜色变黄但液体清亮不浑浊的培养物离心，将沉淀用于牛支原体核酸的提取。

1.2.3 引物 选择牛支原体oppD／F 基因设计2对套式PCR 特异性引物。M.bovis P1、M.bovis P2为外围引物对，外围目的片段长度为1 912bp；M.bovis P3、M.bovis P4为内部引物对，内部目的片段长度为549bp。引物序列为M.bovis P1：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT；M.bovis P2：GGCTCTCATTAAGAATGTC；M.bovis P3：TTTCGCATAACATTAGTGTTGTCGC。

1.2.4 模板的制备 利用SDS蛋白酶K 法提取培养物中的牛支原体基因组DNA 作为套式PCR 检测用的模板。

1.2.5 套式PCR 检测 以提取到的牛支原体培养物基因组DNA 作为模板，利用天根生化科技（北京）有限公司的2×Taq PCR Master Mix 和引物M.bovis P1及M.bovis P2进行第一轮PCR 扩增，循环参数为：94℃5min；94℃30s，48℃30s，72℃120s，30个循环；72℃7min。以第一轮PCR 产物为模板，利用2×Taq PCR Master Mix和引物M.bovis P3及M.bovis P4进行第二轮PCR 扩增，循环参数为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，32个循环；72℃7min。琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像系统进行结果观察。

1.2.6 PCR 扩增产物序列测定及比对 利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA 回收试剂盒进行目的片段的回收，将其与T 载体连接并转化后，通过菌液PCR 挑选阳性克隆，然后将筛选出的阳性克隆扩大培养后送去测序，测序完成后利用GenBank进行比对。

2 结果

2.1 不同牛场血清样品的抗体检测结果

14个牛场中有9 个出现了牛支原体抗体阳性的牛，牛场群感染率为64.29%（9／14）；平均个体感染率为5.85%（11／188），其中奶牛的个体感染率为6%（6／100），肉牛的个体感染率为5.68%（5／88）。

2.2 发病牛病料PCR 检测结果

套式PCR 扩增产物经10g／L 琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品均出现了预期分子质量大小的目的条带，即第1轮目的片段的分子质量为1 912bp，第2轮的为549bp（图1）。采集病料的10个发病牛场有8个出现了支原体PCR 检测结果阳性的牛，牛场群感染率为80%（8／10）；39份病料样品中有19份的PCR 结果为阳性，个体感染率为46.15%（19／38）。

2.3 测序后经GenBank比对结果

将测序结果与GenBank 中的牛支原体序列进行比对后，证实PCR 扩增的目的片段与Hubei－1株的碱基完全相同，同源率为100%；与PG45 株有8个碱基不同，同源性为99%。

图1 病料中牛支原体套式PCR 扩增结果Fig.1 Identification of Mycoplasma bovis from samples by nested PCR

3 讨论

间接ELISA 结果显示，潍坊及周边地区健康牛群牛支原体场群感染率较高，达到了64.29%，这与其他省报道的结果吻合，说明在潍坊及周边的牛场中普遍存在牛支原体的感染，应该引起畜牧兽医部门和养殖户的高度重视。但健康牛群的平均个体感染率为5.85%，在较低的水平，而且奶牛和肉牛的个体感染率相差不大，此结果与文献中报道的差别较大［6－8］，经调查后发现，采集血清样品的健康牛群都是自繁自养，基本不从外地经长途运输的方式引进新的牛只，即使需要从其他牛场引进时，也都经过严格的检疫和适当时间的隔离后才进行混群饲养，这样就很大程度上避免了外来牛对健康牛群造成感染。

从此次采集到的病料PCR 结果可以看出，发病牛场牛支原体的场群感染率和个体感染率均较高，分别达到了80%和46.15%，说明在出现呼吸道症状特别是肺炎表现的牛场中，支原体是造成牛呼吸道类疾病的重要病原之一，但发生此状况的主要原因是牛场的饲养管理水平低下，在受到应激的情况下，牛机体的抵抗力下降，引起牛支原体、细菌、病毒等多种病原混合或继发感染，导致牛的生产性能下降，病死率明显上升，造成了很大的经济损失。

牛支原体在环境中的抵抗力虽然不强，但主要的传播途径是水平传播和垂直传播，特别是垂直传播时，有些牛在母体的子宫内就已经被感染［9］，鉴于牛支原体的上述特点和目前用于预防的疫苗在研发阶段［10－12］及致病机理［13］仍需深入研究的情况，在养殖的过程中要注意综合防控措施的应用，在平时的饲养管理中，给牛提供舒适的生活环境，可口且营养全面的饲料，提高牛自身的抵抗力，如采取下面的措施：保持牛舍的温度和湿度适宜，通风好，不同年龄的牛分舍饲养，防止过度拥挤，定期对牛舍进行消毒，及时清理牛的排泄物，坚持自繁自养，确实需要从外边引进牛时，在引进前对牛进行支原体抗体的检测，杜绝抗体阳性牛的引入，引入后的牛进行至少20d的隔离，安全度过牛支原体的潜伏期，确保牛健康后再与其他的健康牛合群饲养。育肥牛采用全进全出制度，在每批牛出栏后进行彻底的卫生清理和严格全面的消毒。一旦出现可疑病例，要早发现早处理，防止牛支原体病在牛群中大范围的传播和造成严重的经济损失。

［1］ 辛九庆，李 媛，郭 丹，等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［J］.中国预防兽医学报，2008，30（9）：661－664.

［2］ 孔令聪，张春艳，高云航，等.牛支原体耐药性研究进展［J］.中国兽药杂志，2013，47（9）：63－66.

［3］ 孔令聪，高 铎，高云航，等.吉林省育肥牛呼吸系统疾病的病原分离鉴定及耐药性分析［J］.中国兽医杂志，2014，50（1）：34－37.

［4］ 高 铎，孔令聪，王 梓，等.牛支原体的分离鉴定及其体外药物敏感性分析［J］.中国兽药杂志，2014，48（3）：66－68.

［5］ 王海勇，武 华.牛支原体研究进展［J］.中国奶牛，2014（7）：36－41.

［6］ 王伊丽，雷程红，高 窦，等.新疆部分地区牛支原体病的血清学调查［J］.畜牧与饲料科学，2014，35（1）：76－77.

［7］ 李 岩，姚永进，剡根强，等.新疆地区规模化奶牛场牛支原体流行病学调查［J］.中国动物传染病学报，2013，21（5）：68－71.

［8］ 李 静，李 岩，蒲敬伟，等.新疆部分规模化奶牛场5种疫病的血清学调查［J］.动物医学进展，2013，34（11）：24－27.

［9］ Maunsell F P，Donovan G A.Mycoplasma bovis infection in young cattle［J］.Vet Clin North Am Food Anim Pract，2009，25（1）：139－177.

［10］ 张 瑞，崔 朋，巴晓亮，等.牛支原体临床分离株牛体毒力和免疫原性比较［J］.动物医学进展，2013，34（6）：126－132.

［11］ 石 刚，王静梅，剡根强，等.牛支原体改良培养基培养效果观察［J］.动物医学进展，2013，34（3）：129－132.

［12］ 石 刚，王静梅，剡根强，等.四种佐剂对牛支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2013（5）：118－120.

［13］ 王艳杰，李平安，吴太平，等.牛支原体分离株全基因组序列测定及初步分析［J］.动物医学进展，2014，35（8）：44－49.