产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的研制

刘萌萌，樊 金，刘雪慧，秦贵平，张慧蓉，柴同杰

（山东农业大学动物科技与动物医学院，山东泰安271000）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）又名魏氏梭菌，是革兰阳性产芽胞杆菌［1］，在自然界分布广泛，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜肠道中，是重要的人兽共患传染病病原［2］。本菌能产生多种外毒素，根据其主要致病外毒素α、β、ε及ι［3］可分为A、B、C、D、E 5种菌型［4］。产气荚膜梭菌β毒素是由产气荚膜梭菌B 型和C 型菌株产生的坏死、致死性毒素，具有强烈的细胞毒性、致死性和神经毒性［5］，可 引 起 人 和 动 物 坏 死 性 肠 炎［6－7］，具体表现为肠黏膜有出血性坏死，肠壁变薄，容易引起穿孔和破裂［8－10］，还能诱发多种神经系统反应，对人体健康和畜牧业的发展产生严重影响。此类病发病急、病死率高，给各国畜牧业带来巨大经济损失［11－13］。因此，有效的检测出毒素类型并进行针对性的治疗极其重要。单克隆抗体具有质地均一、纯度高、特异性强、效价高等优点，故其可作为标准试剂用于疾病的诊断，同时也可用于疾病的治疗［14－15］。本试验拟建立分泌抗产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株，并鉴定其部分特性，为建立快速有效的临床检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及其他材料 C 型产气荚膜梭菌（NCTC3180）由德国柏林大学提供，山东农业大学环境微生物实验室保存。6周龄～8周龄Balb／c雌性小鼠购于山东大学实验动物中心。pET－28a载体、重组大肠埃希菌BL21（DE3）－β、纯化的重组β毒素蛋白、天然粗提β毒素、骨髓瘤SP2／0 细胞等均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 High Affinity Ni－changed Resin购于南京金斯瑞生物科技有限公司；羊抗鼠IgGHRP 购自南京生兴生物技术有限公司；RPMI－1640、HAT 选择培养基、NCTC生长因子、HT 培养基购自Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青生物制品公司；融合剂PEG1500购自德国Roche公司；卡那霉素、弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒均购自美国Sigma公司；豆粉琼脂购自北京九州天瑞科技有限公司；ELISA Kit（Clostridium perfringens）购自Bio－X 公司；其他所用化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 Balb／c小鼠的免疫 免疫方案：一免用山东农业大学环境微生物实验室制备的重组β毒素与等体积弗氏完全佐剂乳化后，腹腔注射100μg／只；二免、三免分别于首免后2周和5周将重组β毒素蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，腹腔注射100μg／只；三免后3周腹腔注射不加佐剂的重组β毒素蛋白50μg／只～100μg／只。用间接ELISA 方法检测免疫小鼠血清的抗体效价，选取免疫效价检测值最高的小鼠的脾脏用于细胞融合。

1.2.2 杂交瘤细胞株的建立

1.2.2.1 骨髓瘤细胞（SP2／0）和脾细胞的准备于融合前两周复苏SP2／0，置于体积分数为5%CO2培养箱中37℃恒温传代培养。培养过程在培养液中加入8－氮鸟嘌吟，连续处理3次，使SP2／0细胞对HAT 培养液更加敏感。融合前1天传代1次，使融合当天的骨髓瘤细胞处于对数生长期。取免疫效价检测值最高的小鼠，无菌摘取脾脏，收集脾细胞悬液，脾细胞计数后备用。

1.2.2.2 饲养细胞的准备 细胞融合当天，取8周龄～10周龄健康Balb／c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，调整细胞浓度至1×105个／mL～5×105个／mL，按100μL／孔转入到96孔细胞培养板中。

1.2.2.3 细胞的融合 将SP2／0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，使用PEG1500进行化学法融合细胞，然后转入96孔细胞培养板中，置体积分数为5%的CO2培养箱中37℃恒温培养。

1.2.2.4 杂交瘤细胞的筛选 融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，待细胞长到孔底的1／4～1／3时吸出上清进行间接ELISA 检测。以P／N≥2.5作为阳性判断标准，用未免疫小鼠血清作阴性对照，用抗体稀释液做空白对照。对检测为阳性的细胞进行扩大培养，同时进行克隆化培养。

1.2.2.5 杂交瘤细胞的克隆化培养 克隆化培养采用有限稀释法，待细胞长到孔底的1／4～1／3时，对细胞上清进行间接ELISA 检测。选择克隆数少、OD450nm 值高的阳性孔，将其再次克隆。经3 次～4次克隆操作，至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100%时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。

1.2.2.6 杂交瘤细胞的扩大培养及冻存 单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100%。将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养。扩大培养后，部分进行小鼠的腹腔注射，体内生产腹水。另一部分可采用液氮冻存。

1.2.2.7 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定 将阳性杂交瘤细胞株连续培养两个月后，用已经建立的间接ELISA 方法检测细胞培养上清的抗体效价。

1.2.3 单克隆抗体亚类鉴定 细胞培养上清中的单克隆抗体亚类通过试剂盒进行鉴定，按照试剂盒说明操作。

1.2.4 单克隆抗体腹水制备 取状态良好的6周龄～8周龄Balb／c雌性小鼠，腹腔注射500μL弗氏不完全佐剂，7d后取生长旺盛的阳性杂交瘤细胞，腹腔注射0.5×106个／只～1×106个／只，注入细胞1周后，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，1 200r／min离心10min，收集上清置－80℃保存备用。

1.2.5 单克隆抗体的纯化 采用正辛酸－硫酸铵的方法纯化腹水［14］，具体纯化过程如下：将制备的腹水1 000r／min离心15min后用0.45μm 滤器过滤，将滤液加入100mL烧杯中，用磁转子边搅拌边将4倍体积60mmol／L（pH4.5）的醋酸缓冲液慢慢加入；缓慢滴入正辛酸使其终浓度为33μL／mL，室温搅拌30min；8 000r／min离心30min后，收集上清；滤纸过滤，调pH 至7.4；边搅拌滤液边加入饱和（NH4）2SO4，待滤液呈现白色浑浊后，继续搅拌10min；于4℃静置5h后，4℃离心30min，弃上清；用10mmol Tris－HCl（pH9.0）重悬沉淀，装入处理好的透析袋后放入100 倍体积的10 mmol Tris－HCl（pH9.0）中，磁力搅拌透析36h（4℃），期间每12h换液1次；最后3 000r／min离心15min，上清便是纯化的单克隆抗体。取上清作SDS－PAGE 试验，分析单抗大小及纯化效果。

1.2.6 单克隆抗体的特性鉴定

1.2.6.1 腹水中单克隆抗体效价的测定 用重组β蛋白包被酶标板，采用间接ELISA 操作方法检测制备的单克隆抗体的效价，其中二抗为HRP 标记的羊抗鼠IgG。

1.2.6.2 单克隆抗体特异性鉴定 将重组β毒素蛋白、本实验室保存的粗提天然β毒素、重组α毒素蛋白和重组ε毒素蛋白分别包被96孔酶标板，用制备的各株单克隆抗体分别进行间接ELISA 方法的检测，鉴定各株单克隆抗体的特异性。

1.2.6.3 单克隆抗体反应原性测定 用Western blot分析各株单克隆抗体分别与重组β毒素蛋白的反应性。

2 结果

2.1 免疫小鼠抗体效价检测结果

前3次免疫后，用间接ELISA 方法检测小鼠血清抗β毒素的效价结果均在1∶25 600以上，在此条件下进行加强免疫后，挑选效价最高的小鼠于4d后摘除脾脏进行细胞融合。

2.2 融合细胞的筛选及克隆

细胞融合后，选择阳性孔OD 值高的，细胞集落数目较少，细胞生长状态良好的孔进行克隆，经过3次克隆，得到3株能稳定分泌β毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1E6E11C7、2C8A5E8、1E3G10G9D9。

2.3 杂交瘤细胞株的建立

经多次传代培养，杂交瘤细胞生长旺盛，形态良好（图1）。

图1 杂交瘤细胞的生长状态Fig.1 Growth state of the hybridoma

2.4 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定

将阳性杂交瘤细胞株连续培养3个月后，用已经建立的间接ELISA 方法检测一次各株细胞培养上清的抗体效价结果均为1∶25 600。说明经过多次传代后，各株杂交瘤细胞仍具有稳定的分泌能力。

2.5 单克隆抗体亚类鉴定

利用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测结果见表1，可 知 单 抗1E6E11C7、2C8A5E8 为IgG1 型，1E3G10G9D9为IgG2a型。

表1 单克隆抗体亚类鉴定结果Table 1 Results of isotype identification of monoclonal antibodies

图2 腹水的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of ascitic fluids

2.6 单克隆抗体的纯化

腹水经正辛酸－硫酸铵法纯化后，经120g／L 的SDS－PAGE凝胶电泳试验分析，可见两条明显的蛋白条带，即53ku左右的重链和23ku左右的轻链，且无其他杂带，表明纯化效果好、纯度较高（图2）。

2.7 单克隆抗体的特性鉴定

2.7.1 腹水中单克隆抗体效价的测定 用间接ELISA 方法检测腹水中单克隆抗体效价，用重组的β毒素作为抗原包被酶标板，用HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗（表2）。

2.7.2 单克隆抗体特异性鉴定 用间接ELISA 方法分别检测各株单抗与重组β毒素蛋白、粗提天然β毒素、重组α毒素蛋白和重组ε毒素蛋白反应情况结果显示，各株单抗均能与重组β毒素蛋白、天然β毒素反应且有较高效价，而不与重组α毒素蛋白和重组ε毒素蛋白反应（表3）。

表2 腹水中单克隆抗体效价检测结果Table 2 The detection results of monoclonal antibody titers in ascites

表3 3株单克隆抗体特异性检测结果Table 3 3strains of monoclonal antibody specificity test results

2.7.3 Western blot试验结果 用Western blot方法分别检测了各株单克隆抗体与重组β毒素反应性，试验结果显示（图3），NC 膜上的条带出现在38 ku处，与重组β毒素大小一致，这表明，试验制得的单克隆抗体能特异性识别并结合重组β毒素。

3 讨论

图3 单克隆抗体的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of monoclonal antibody

单克隆抗体对操作技术的要求比较苛刻，因此在制备过程中每一步都要严格认真，只有每个细节都没有失误才能保证成功。在选择抗原方面，要尽量选择纯度高、抗原性强的抗原来免疫动物，本研究经原核表达的β毒素完全符合此要求，用其免疫动物，后期试验才得以顺利进行。在制备过程中，为了防止细胞被污染，对于所有细胞进行培养的过程中一定要做到严格无菌操作，细胞间使用前一定要进行紫外灭菌，所需试验材料要提前进行高温消毒杀菌。在用超净工作台进行操作前一定要对工作者进行消毒。

本试验制备了3 株能稳定分泌产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞。经鉴定，单抗1E6、2C8为IgG1型，1E3为IgG2a型。对单抗进行亚类的鉴定是很重要的一步，就目前来说一般的制备技术制出的单抗大部分是IgG 类或IgM 类。IgG 类稳定性较高，效价一般不会下降，而IgM 类的抗体本身就不太稳定，效价随时间推移可能出现降低，因此研究中一般不用IgM 类抗体做功能学试验，只能简单做细胞的表形分析，因此关于单抗的制备，要尽量制得IgG亚类单抗。

单克隆抗体在畜牧领域的应用越来越广泛，而其纯度与活性是影响其质量的关键因素。当前实验室常用的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b类单克隆抗体纯化方法中，常用沉淀法和层析法［16］。本研究采用正辛酸－硫酸铵沉淀法进行腹水的纯化，试验证明此方法纯化效果良好。与层析法相比正辛酸－硫酸铵沉淀法操作简便，抗体回收率高，抗体活性高，生产成本较低。利用此方法纯化单克隆抗体，有一定的应用价值。

［1］ Carman R J，Sayeed S，Li J，et al.Clostridium perfringens toxin genotypes in the feces of health North American［J］.Anaerobe，2008，14（2）：102－108.

［2］ 李 璐，赵宝华.产气荚膜梭菌主要致死性毒素的研究进展［J］.畜牧与饲料科学，2011，32（4）：94－97.

［3］ Garcia J P，Beingesser J，Fisher D J，et al.The effect of Clostridium perfringens type C strain CN3685and its isogenic beta toxin null mutant in goats［J］.Vet Microbiol，2012，157：412－419.

［4］ 王玉炯.产气荚膜梭菌β毒素研究进展［J］.宁夏农学院学报，1999，3（20）：74－78.

［5］ Gurjar A，Li J，McClane B A.Characterization of toxin plasmind in Clostridium perfringens type C isolates［J］.Immunity，2010，7（78）：4860－4869.

［6］ Rood J I，Cole S T.Moleclar genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1991，55：621－648.

［7］ 柴同杰，马瑞华，常维山，等.产气荚膜梭状芽胞杆菌病的流行与致病机制［J］.中国预防兽医学报，2001（1）：71－73.

［8］ Ahmed F E.Detection of genetically modified organisms in foods［J］.Trend Biotechnol，2002，20（5）：215－223.

［9］ 柴同杰，刘文波.产气荚膜梭菌类毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律［J］.中国预防兽医学报，2006，28（1）：101－104.

［10］ Coursodon C F，Trinh H T，Mallozzi M.Clostridium perfringens alpha toxin is produced in the intestines of broiler chicks inoculated with an alpha toxin mutant［J］.Anaerobe，2010，16（6）：614－617.

［11］ Bacciarini L N，Boerlin P，Straub R，et al.Immuno－histochemical localization of Clostridium perfringens β2－toxinin the gastrointestinal tract of horses［J］.Vet Pathol，2003，40（4）：376－381.

［12］ Gharaibeh S，Rifai R，Majali A.Molecular typing and antimicrobial susceptibility of Clostridium perfringens from broiler chickens［J］.Anaerobe，2010，16（6）：586－589.

［13］ Jolivet－Reynaud C.Entero pathogenicity of Clostridium perfringensβ－toxin and other clostridial toxins［J］.Zentralbl Bacteriol Microbiol Hyg Abt，1986，15：145－151.

［14］ 孙佳芝，王新桐，刘雪慧，等.产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA 检测方法的建立及初步应用［J］.中国兽医学报，2014，34（6）：930－941.

［15］ Amimoto K，Noro T.A novel toxin homologous to large clostridial cytotoxins found in culture supernatant of Clostridium perfringens type C［J］.Microbiology，2007，153：1198－1206.

［16］ 肖增鸿，黄昭亮，林月霞，等.腹水型单克隆抗体纯化方法的研究［J］.中国医药生物技术，2013，8（6）：425－428.