C17－吡唑琳基甾体衍生物诱导Hela 细胞凋亡研究

范宁娟，白育斌，师 伟，段 敏＊

（1.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学理学院，陕西杨凌712100）

在甾体分子结构的D－环引入含N、O、S等杂原子的杂环后将使得甾体衍生物呈现广泛的生物活性［1］。在杂环衍生物中，吡唑啉基甾体化合物因为具有止痛、抗菌、抗癌等功效为人们所熟悉，合成含有吡唑啉基的此类衍生物已经成为甾体结构改造和修饰的重 要 分 支［2－5］。2013 年，我 们 合 成 了 一 系 列新颖的吡唑啉基甾体衍生物，体外细胞毒活性试验显示部分化合物对肺癌（NCI－H460）、宫颈癌（Hela）和肝癌（HepG2）3种人体癌细胞具有较好的抑制活性，其中化合物1对Hela细胞的半数抑制率为12.5 μg／mL，细胞周期分析试验证明吡唑啉基甾体衍生物1（图1）具有诱导细胞周期停滞的特性［6］。据此推测吡唑啉基甾体衍生物1抑制Hela细胞增殖的活性可能与其诱导细胞周期停滞有关。

图1 吡唑啉基甾体衍生物1结构式Fig.1 Structure of derivative 1of steroidal derivatives

为了进一步研究其生物学功能，本研究将检测C17－吡唑琳基甾体衍生物1对Hela细胞的凋亡的作用及机制，为进一步明确其抗肿瘤活性研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Hela细胞购于中国科学院细胞库细胞株信息库。RPMI－1640培养液、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）购 自Gibico 公 司；Caspase－3、Caspase－8、Caspase－9活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术 有 限 公 司；Bax、PARP、Bcl－2、β－actin 抗 体 购 于Santa Cruz。辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和ECL 显 色 试 剂 盒 购 自Pierce 公 司；Annexin－VFITC／PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品合成 C17－吡唑琳基甾体衍生物1参考文献［6］进行合成，将合成的样品溶于二甲基亚砜（DMSO）中，最终配制成2μg／μL 的储存液（含0.5 mL／L DMSO）备用，DMSO终浓度不超过10mL／L。

1.2.2 细胞培养与处理 Hela细胞用100 mL／L胎牛血清的DMEM 培养基，37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养。用2.5mL／L 的胰蛋白酶（含0.4mL／L的EDTA）消化传代。

1.2.3 形态学观察 将Hela细胞接种至12孔板，待贴壁后，用12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理12、24、36、48h，吸弃培养基，每孔加入200μL的PBS和2μL的AO／EB染色液（各含100 μg／mL），室温避光孵育10min，用倒置荧光显微镜观察并拍照。用DMSO 处理的细胞作为阴性对照。

1.2.4 流式细胞仪检测吡唑啉基甾体衍生物1对Hela细胞凋亡率的影响 将Hela细胞接种于6孔板中，用，同时设置不用药物处理的正常细胞为对照，于药物处理后不同的时间点（0、12、24、36、48h）收集细胞，1 000r／min 离心5 min，弃掉上清，用PBS洗涤2次，收集细胞。先加入195μL Annexin V－FITC结合液轻轻重悬细胞，然后加入5μL Annexin V－FITC 和10μL 碘化丙啶染色液，轻轻混匀，最后于室温（20℃～25℃）避光孵育10min～20 min。孵育过程中可以重悬细胞2 次～3 次以改善标记效果。随即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 用分光光度法检测Caspase－3、－8和－9的活性 用12.5μg／mL 的药物处理Hela细胞，分别于不同时间点（0、12、24、36、48h）收集细胞。按照试剂盒说明书在收集的沉淀细胞中加入200μL 的Lysis buffer，吹打均匀，置冰上裂解1h，其间涡旋振荡3次，10 000r／min 离心1min，吸取上清至新的1.5mL EP管中。用BCA 法检测所提取的蛋白质浓度。分别吸取50μL 含总蛋白量为150μg的细胞裂解上清液，然后加入50μL 的2×Reaction buffer和5μL 的Caspase substrate，37 ℃避光孵育4h。以Lysis buffer 和Reaction buffer作为空白对照。在400nm 波长处测定吸光度值。

1.2.6 Western blot检测凋亡相关因子的变化

①细胞总蛋白的提取。收集细胞，PBS洗2次，加入400μL的预冷的含有1mmol／L PMSF的RIPA 裂解液，冰上裂解1h，期间涡旋混匀4 次，12 000r／min离心20min，取上清，加入4×loading buffer，煮沸10min，置－80℃保存备用。②线粒体蛋白与细胞浆蛋白的提取。收集细胞，PBS洗2次，4 ℃、600r／min离心10min，弃上清。加入1mL含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的线粒体分离试剂，重悬细胞，匀浆细胞，4 ℃、600r／min离心10 min，将上清移至新的离心管中，4℃、11 000r／min 离心10 min（上清为去除了线粒体的胞浆蛋白液，沉淀为线粒体）。冷却后，置于－80℃中保存备用。③Western blot分析与细胞凋亡相关因子的变化。取30μg蛋白样品进行SDS－PAGE电泳，将蛋白转至用甲醇活化的PVDF膜上，用含有50g／L脱脂奶粉的PBS封闭2h，用含20g／L 脱脂奶粉的一抗4 ℃孵育过夜。次日，将PVDF 膜用PBST 洗涤3 次，每次6 min。然后将PVDF膜置于用20g／L脱脂奶粉稀释的HRP标记的二抗中，室温孵育1h，将PVDF 膜用PBST 缓冲液振摇洗涤5次，每次5min。将ECL试剂显影。

1.2.7 统计分析 将试验所得结果用统计学软件SPSS 19.0 进行单因素方差分析，试验数据运用Dunnet t的双尾检验多重比较法进行显著性检验，＊表示差异显著（P＜0.05），＊＊表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果

2.1 C17－吡唑琳基甾体衍生物1诱导Hela细胞凋亡的形态学变化

透射电镜观察C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理的Hela细胞，细胞核浓缩，随着时间的延长，细胞核发生明显的碎裂（图2A）。荧光显微镜下观察AO／EB 染色后的Hela 细胞，对照组细胞只被AO 染色，细胞核内呈均匀的亮绿色荧光；而处理组细胞于12h开始出现核内染色质固缩，随着处理时间的延长，细胞核发生明显的碎裂，晚期凋亡细胞的胞核内出现红色斑点（图2C）。

2.2 C17－吡唑琳基甾体衍生物1对Hela细胞凋亡率的影响

根据Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，运用双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示，药物处理细胞24h时，细胞凋亡率为21.3%，与对照组相比显著极差异，在48h时细胞的凋亡率为52.4%，与对照组相比差异极显著，表明C17－吡唑琳基甾体衍生物1能够诱导Hela细胞发生凋亡，且细胞的凋亡率与处理时间正相关（图2B）。

图2 吡唑啉基甾体衍生物1诱导Hela细胞凋亡Fig.2 C17－pyrazolinyl steroidal derivative induced apoptosis of Hela cells

2.2 C17－吡 唑 琳 基 甾 体 衍 生 物1 对Hela 细 胞Caspase活性的影响

利用Caspase检测试剂盒检测C17－吡唑琳基甾体衍生物1对Hela细胞Caspase分子的活化的影响。12.5μg／mL的C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理Hela细胞后，Caspase－8分子活性无显著变化；而Caspase－3和Capase－9分子的活性在药物处理12h后发生了显著变化，在36h时，Caspase－3与Caspase－9的活性达到最高，与0h对照组细胞相比活性分别增加到了6.22和3.76倍，差异极显著（图3A）。

2.3 C17－吡唑琳基甾体衍生物1促进Caspase－3的切割底物PARP的降解

Caspase－3的切割底物PARP 在C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理后12h开始发生降解，随着药物处理时间的延长，PARP发生降解的程度越明显，表明PARP能够被活化后的Caspase－3 切割，细胞内存在依赖于Caspase－3的其他凋亡信号转导通路被激活（图3B）。

2.4 C17－吡唑琳基甾体衍生物1 对线粒体通路中Bax与Bcl－2蛋白表达水平的影响

Western blot检测表明，C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理Hela细胞后，细胞内促凋亡蛋白Bax表达量随处理时间而增加，抑凋亡蛋白Bcl－2表达量则逐渐降低（图4A）。

2.5 C17－吡唑琳基甾体衍生物1 对线粒体通路中Bax与Cytochrome c转位的影响

通过Western blot检测表明，药物处理Hela细胞12h后，可以在胞浆中检测到Cytochrome C，并且其表达量随时间的延长而逐渐增加，说明Cytochrome C由线粒体释放到胞浆，同时在胞浆中Bax表达量随时间延长而降低（图4B）。

图3 吡唑啉基甾体衍生物1对Hela细胞Caspase活性的影响Fig.3 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Caspases activities of Hela cells

图4 C17－吡唑啉基甾体衍生物1对Hela细胞Ba、Bcl－2和细胞色素C的作用Fig.4 The effect of C17－pyrazolinyl steroidal derivative on Bax，Bcl－2，and cytochrome C in Hela cells

3 讨论

细胞凋亡是一种由基因控制的程序性细胞死亡［7］。细胞形态学观察发现，早期凋亡时，细胞核固缩，核内染色质凝集，细胞质浓缩。中晚期凋亡时，细胞膜内陷，细胞核碎裂，有凋亡小体的产生［8］。本研究利用AO／EB 染色，观察C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理后Hela细胞核形态变化，发现经药物处理的Hela细胞的染色质固缩，随着处理时间的延长，核碎裂更加严重，最终导致凋亡小体的产生，为典型的凋亡细胞特征。

Caspases蛋白酶为天冬半胱氨酸蛋白酶，其介导的蛋白质裂解在细胞凋亡过程中起着重要的作用［9］。细胞凋亡的信号通路主要包括死亡受体通路和线粒体通路［10］。死亡受体通路主要依赖于Caspase－8活化，线粒体通路的激活主要依赖于Caspase－9活化［11］。本研究检测了Caspases活性，C17－吡唑琳基甾体衍生物1处理后，能够活化Hela细胞内的Caspase－3 和Caspase－9，而Caspase－8 的活性没有显著差异，表明该药物能够通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡。

Bcl－2家族在细胞凋亡过程中起重要作用，其家族成员主要包括促凋亡蛋白Bax、Bad、Bak 和抑凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－XL、Bcl－w 等，其中Bcl－2 和Bax是调控细胞凋亡的两个关键蛋白［12－14］。本研究发现，C17－吡唑琳基甾体衍生物1 处理Hela细胞后，Bax／Bcl－2的比率升高，胞浆内游离的Bax 转移到线粒体中，从而改变了线粒体膜的通透性，进而使线粒体中的促凋亡分子Cyt c释放到胞质中，参与线粒体介导的细胞凋亡通路。综上所述，合成的C17－吡唑琳基甾体衍生物1 能够通过线粒体途径诱导Hela细胞发生凋亡，为进一步研究其抗肿瘤作用提供了依据。

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