前列腺素E2受体1亚型在转化生长因子β1诱导小鼠系膜细胞损伤中的作用机制

马 雯 徐玉音 仇 芝 范亚平 陈晓岚

前列腺素E2受体1亚型在转化生长因子β1诱导小鼠系膜细胞损伤中的作用机制

马 雯 徐玉音 仇 芝 范亚平 陈晓岚

目的:探讨前列腺素E2受体1亚型(EP1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠肾小球系膜细胞(MCs)增殖、细胞外基质的影响及可能机制。方法:体外原代培养MCs。采用脂质体LipofectamineTM 2000化学合成法将siRNA转染至MCs中沉默EP1受体，筛选干扰效率最大的EP1-siRNA片段。实验分组:(1)正常对照组;(2)TGF-β1(10 ng/ml)组;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/m l)组;(4)EP1-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)组;(5) EP1-siRNA组。ELISA法检测各组细胞上清中前列腺素E2(PGE2)的表达，实时荧光定量PCR方法检测各组细胞纤维连接蛋白(FN)、结缔组织生长因子(CTGF)、环氧化酶2(COX2)、膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1) mRNA的表达。Western blot法检测FN、CTGF、COX2、mPGES-1蛋白及p38MAPK、ERK活性的变化。结果:与正常对照组相比，TGF-β1组FN、CTGF、COX2、mPGES-1的mRNA和蛋白的表达上调(P＜0.05);与TGF-β1组相比，EP1-siRNA+TGF-β1组FN、CTGF、COX2、mPGES-1的mRNA和蛋白的表达下调(P＜0.05);TGF-β1刺激后，p38MAPK、ERK磷酸化水平明显增强(P＜0.05)，EP1-siRNA+TGF-β1组，p38MAPK、ERK磷酸化水平较对照组明显下调(P＜0.05)。结论:EP1-siRNA可能通过抑制ERK和p38MAPK磷酸化减轻TGF-β1诱导的小鼠系膜细胞损伤。

前列腺素E2受体1亚型siRNA转化生长因子β1系膜细胞信号通路

肾脏纤维化是各种慢性肾脏病(CKD)的主要病理改变，也是进展到终末期肾病(ESRD)的共同途径，主要病理特点为肾脏细胞外基质(ECM)生成细胞的活化，而系膜细胞(MCs)是肾脏ECM生成的主要固有细胞之一。受到损伤时，MCs的反应是增殖、发生表型改变并产生ECM主要成分，如纤维连接蛋白(FN)、结缔组织生长因子(CTGF)等，直接导致和加剧ECM在肾小球沉积，参与肾小球硬化的发生发展过程，最终导致肾纤维化。ERK和p38MAPK是重要的丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MARKs)通路，其在肾纤维化过程中发挥重要作用。有报道称，ERK和p38在糖尿病(DM)大鼠肾小管上皮细胞被激活，其可能介导高糖诱导的细胞肥大和转化生长因子β (TGF-β)的表达［1］。TGF-β是公认的致纤维化生长因子，是ECM沉积、肾纤维化进展的重要调节因子，还能够刺激MCs环氧化酶2(COX2)/膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES1)的表达及其代谢产物前列腺素E2(PGE2)的合成。

PGE2是肾脏中一种主要的花生四烯酸代谢产物，通过与4种7次跨膜的G蛋白偶联前列腺素受体(EP1～EP4)作用而广泛参与肾脏多种生理和病理生理过程，包括参与调节血管平滑肌收缩、肾小球滤过、肾素释放及肾小管水盐转运等［2］。目前EP1受体在慢性肾脏病肾纤维化发生机制中的作用所知甚少。

RNA干扰(RNAi)技术是一种新兴的基因治疗技术，是发生于mRNA水平的转录后基因沉默技术。可在哺乳动物细胞组织内起到基因封闭作用，其结构稳定，无须像反义寡核苷酸那样进行广泛的化学修饰才能提高其半衰期，而且干扰RNA(siRNA)能在低于反义寡核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因降至低水平甚至完全“敲除”，从而产生缺失突变型［3，4］。因此本研究中，我们原代培养野生型小鼠MCs，并采用了脂质体LipofectamineTM 2000化学合成法将siRNA转染至小鼠系膜细胞中干扰PGE2受体1亚型(EP1)受体，筛选最佳EP1-siRNA序列并用最佳的siRNA沉默MCsEP1受体，同时给予TGF-β1刺激，研究EP1受体抑制后，TGF-β1诱导的小鼠肾小球系膜细胞FN、CTGF、COX2、mPGES1蛋白和mRNA的表达及下游信号通路p38、ERK活性的变化，探讨EP1受体是否参与肾脏纤维化的发生及可能机制，为CKD的治疗提供新的思路。

材料和方法

材料和试剂DMEM细胞培养基粉剂(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，重组人TGF-β1(英国PeproTech)，siRNA(上海吉玛公司)，CCK-8试剂盒，Ttizol RNA抽提试剂盒(Invitrogen公司)，PGE2 ELISA试剂盒(美国R＆D)，逆转录试剂盒(美国fermentas)，实时定量PCR试剂盒(罗氏)，八联管(荷兰BIO plastics)。细胞培养箱(美国Thermo)，实时荧光定量PCR仪(美国MJ)，Western印迹设备(美国Bio-Rad)，酶标仪(美国Bio-Rad)。β-actin、FN、CTGF、COX2、mPGES-1单克隆抗体(美国abcam公司)，ERK、p38MAPK单克隆抗体，磷酸化ERK、p38MAPK单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，EP1抗体(Cayman公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)，FN、CTGF、COX2，mPGES1引物(上海invitrogen公司)。二甲基亚砜(Sigma公司)，细胞裂解液、ECL显影剂(碧云天)，PVDF膜。

siRNA的设计由上海吉玛公司设计并合成针对EP1-mRNA的3条特异性siRNA，作为阴性对照的无义siRNA(Negative control siRNA，NC-siRNA)。3条设计序列如下:EP1-siRNA-1(siRNA-1)正义链5'-GGUGUUUUAUUAGCCUUGGTT-3'，反义链5'-CCAAGGCUAAUAAAACACCTT-3';EP1-siRNA-2(siRNA-2)正义链5'-GCUGCCAACAGGCGAUAAUTT-3'，反义链5'-AUUAUCGCCUGUUGGCAGCTT-3';EP1-siRNA-3 (siRNA-3)正义链5'-GCUCUCGACGAUUCCGAAATT-3'，反义链5'-UUUCGGAAUCGUCGAGAGCTT-3'。

siRNA的筛选转染前一天约5×105系膜细胞接种于六孔板中，使用含血清不含抗生素的培养基培养，第2天细胞达到70%～90%融合后，换无血清、无抗生素的培养液，备用于转染。MCs分组为对照组、NC-siRNA组、siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组。按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染三种EP1-siRNA，37℃，5%CO2培养箱培养，4～6h后换有血清的培养基同时加入TGF-β1 2μl，继续培养。24h后实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组系膜细胞EP1mRNA的表达情况，筛选干扰效率最大的siRNA片段。

原代小鼠MCs培养和分组取8～12周龄C57BL6雄性小鼠(南通大学实验动物中心提供)，在无菌条件下取肾脏，将皮质剪碎，分别过滤70μm，40 μm筛网，取40μm筛网上的肾小球，离心收集消化的肾小球，加入DMEM完全培养液，于37℃、5%CO2孵箱中培养4～6d后换液，后每2～3d换液1次，约2～3周系膜细胞长满瓶底，经形态学和免疫细胞化学鉴定证实为系膜细胞［5］，0.25%胰蛋白酶消化传代，取第8～10代系膜细胞分组进行实验。实验分组: (1)正常对照组;(2)TGF-β1(10 ng/ml)组;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)组;(4)EP1-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)组;(5)EP1-siRNA组。

小分子siRNA实验调整原代小鼠系膜细胞浓度为1×105/ml，接种于六孔板，孵育过夜，待细胞生长至70%～80%融合时，更换为无血清培养基，将合成的EP1-siRNA和Negative control siRNA(NC-siRNA)按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染入WT小鼠系膜细胞，培养12h后追加20%FBS同时给予10 ng/ml TGF-β1干预24h。

ELISA方法检测各组系膜细胞内PGE2含量取对数生长期的小鼠系膜细胞接种于6孔板(1×105/孔)，置于CO2培养箱中培养，同步静止后分别进行siRNA转染，孵育4～6h后，加入10μg/L的TGF-β1，对照组加入等体积0.1%的BSA，24h后，取上清，按照ELISA试剂盒说明进行PGE2含量的测定。

RT-PCR按Trizol试剂说明书提取各组MCs的总RNA，用紫外分光光度计测定浓度后，取2μg总RNA进行逆转录反应。采用RT-PCR仪以20μl反应体系进行PCR扩增。每个样品均采用3复孔。PCR热循环参数:50℃2 min→95℃10 min→(95℃15s→60℃60s)×40。样本扩增结果用GADPH的浓度校正，得出的值按公式2－△△Ct求出基因表达的相对变化量，再进行各组间比较。引物由上海invitrogen公司合成，序列如表1。

表1 实时荧光定量PCR引物分析

Western印迹法检测蛋白的表达用PMSF及IP细胞裂解液提取系膜细胞总蛋白。紫外分光光度计测蛋白浓度。10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，封闭液(1×TBST，5%脱脂奶粉)封闭2h，加入一抗抗-FN、CTGF、COX2、mPGES1、ERK、p-ERK、p38MAPK、pp38MAPK、单克隆抗体，4℃过夜。1×TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记二抗FN、、CTGF、COX2、mPGES-1、ERK、p38MAPK、p-ERK、p-p38MAPK、和-actin:抗兔，1∶1 000稀释;室温下孵育2h，1×TBST洗膜3次，最后用ECL化学显色剂(北京Applygen公司)进行显影。结果用吸光度扫描分析软件Image J6.0进行分析，其中p-ERK，p-p38MAPK，与ERK，p38MAPK比值代表ERK，p38MAPK的活化度。其余蛋白表达量用内参照-actin校正。

统计学分析SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量数据以x ±s表示，各组间进行组间单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

最佳EP1-siRNA序列的筛选RT-PCR法检测转染后各组系膜细胞中EP1 mRNA的表达结果显示，转染siRNA-3的细胞中EP1 mRNA的表达水平与对照组和NC-siRNA组比较，均显著降低(P＜0.05)，转染siRNA-1和siRNA-2的细胞中EP1 mRNA的表达无明显的变化。对照组和NC-siRNA组细胞中EP1 mRNA表达水平差异无统计学意义，排除了转染试剂的作用并且证实了siRNA分子对靶基因抑制作用的特异性。根据实验结果，我们选取siRNA-3用于后续试验(图1A、B)。

各组小鼠肾小球MCs培养上清中PGE2含量的影响ELISA结果显示，与TGF-β1组和NC-siRNA+ TGF-β1组比较，EP1-siRNA+TGF-β1组细胞培养上清中PGE2的表达均明显下调(P＜0.05)(图1C)。

siRNA转染后各组TGF-β1诱导的系膜细胞FN、CTGF表达的影响Western Blot检测结果显示，10 ng/ml TGF-β1刺激各组细胞后，与正常对照组比较，TGF-β1组、NC-siRNA+TGF-β1组和EP1-siRNA+TGF-β1组细胞FN、CTGF蛋白表达量明显增加(aP均＜0.05，图2A、C);与TGF-β1组和NC-siRNA+TGF-β1组比较，EP2-siRNA+TGF-β1组细胞FN、CTGF蛋白表达量显著减少(bP＜0.05，cP＜0.05，图2A、C);RT-PCR结果与Western Blot结果一致(图2B)。

图1 转染后各组肾小球系膜细胞EP1 m RNA的表达(RT-PCR)

图2 各组系膜细胞FN、CTGF的表达(W estern Blot)TGF-β1:转化生长因子β1;EP1:前列腺素E2受体1亚型;FN:纤维连接蛋白;CTGF:结缔组织生长因子; NC:阴性对照;a:P＜0.05 vs正常对照组;b:P＜0.05 vs TGF-β1组;c:P＜0.05 vs NC-siRNA+TGF-β1组

siRNA转染后TGF-β1诱导的各组系膜细胞PGE2合成通路中合酶的影响:RT-PCR和Western Blot检测结果显示，10ng/ml TGF-β1刺激后，与对照组比较，各组细胞COX2、mPGES1 mRNA和蛋白的表达明显上调(P＜0.05);EP1-siRNA+TGF-β1组COX2、mPGES1 mRNA和蛋白的表达比阴性对照组减少(P＜0.05)(图3)。

siRNA转染后各组TGF-β诱导的系膜细胞p38MAPK和ERK磷酸化水平为了进一步了解EP1受体下游的相关信号通路分子的变化，我们采用Western Blot法观察各组细胞p-p38MAPK，p-ERk的表达情况。结果显示，10 ng/ml TGF-β1刺激后，TGF-β1组p-p38MAPK、p-ERk的表达显著增加(P＜0.05);EP1受体沉默后，EP1-siRNA+TGF-β1组p-p38MAPK、P-Erk蛋白的表达比阴性对照组明显下调(P＜0.05)(图4)。

讨论

随着对肾纤维化机制研究的深入，前列腺素系统的作用受到广泛关注［6，7］。有报道发现在肾小球系膜区存在明显的EP1原位杂交信号，高糖条件诱导的系膜细胞增殖几乎可以被EP1拮抗剂完全抑制［8］。动物实验证明前列腺素受体EP1选择性拮抗剂能有效阻止链脲佐菌素(STZ)诱导的大鼠糖尿病肾病的发展［8］，减轻高血压引起的大鼠肾损害［9］。还证明了EP1拮抗剂(EP1A)治疗显著可改善卒中易感型自发性高血压大鼠(SHRSP)中肾损伤的组织学和功能，即使在高血压发病和出现蛋白尿时［8］。以上研究说明EP1可能参与了肾脏的多种病理生理过程。但是目前关于EP1在慢性肾纤维化作用方面还没有相关报道。本文主要探究EP1在肾脏纤维化发生过程中的作用及可能机制。

图3 各组肾小球系膜细胞PGE2合成通路中合酶的表达(Western Blot)TGF-β1:转化生长因子β1;EP1:前列腺素E2受体1亚型;COX2:环氧化酶2;mPGES1:膜结合型前列腺素E2合酶1;NC:阴性对照;a:P＜0.05 vs正常对照组;b:P＜0.05 vs TGF-β1组;c:P＜0.05 vs NC-siRNA+TGF-β1组

图4 siRNA转染后各组细胞p-p38MAPK，p-ERk的表达(W estern Blot)

CTGF是TGF-β1的下游效应介质，后者具有促有丝分裂、细胞趋化、诱导黏附、促进细胞增殖及ECM合成的作用，在血管和软骨生成、组织修复、肿瘤和组织纤维化中发挥重要病理作用［10］。在人类MCs发现TGF-β1和CTGF皆具有显著的诱导胶原合成的作用，目前在糖尿病肾病和多种进展型肾脏疾病中已证实CTGF的表达显著上调。我们的实验结果显示，小鼠MCs EP1沉默后，与对照组相比，TGF-β1诱导FN、 CTGFmRNA和蛋白的表达及MCs增殖明显增加，而siRNA+TGF-β1组的FN、CTGF表达则显著降低。提示EP1可能参与了MCs增殖过程，而且抑制EP1受体表达可能减轻TGF-β1的促纤维化作用。

COX2是PGE2合成过程中重要的酶，在多种肾脏疾病的动物实验及临床观察中都发现COX2上调，提示环氧酶激活可能在肾脏疾病发病机制和发展过程中具有重要病理作用［11，12］。研究证明，mPGES-1主要与COX2偶联发挥作用，尤其是在多种前炎症因子诱发的迟发型反应中，mPGES-1和COX2在多种组织表达都显著上调，同时伴PGE2合成增加［13－15］，在诸多病理过程中发挥重要的作用。在本研究中，siRNA转染肾小球MCs使EP1沉默后，COX2表达水平下调;而mPGES-1的表达也被下调。以上研究提示相互偶联的COX2/mPGES-1可能在MCs损伤过程中发挥重要作用，而mPGES-1的高水平表达对于MCs后续PGE2的产生和EP1受体的激活至关重要。我们检测了各组MCs培养液中PGE2的表达，结果显示TGF-β1刺激后，PGE2的表达上调，EP1沉默后，PGE2的表达下调。因此我们推测TGF-β1刺激后，COX2/mPGES-1表达增加，可能使PGE2表达上调及激活EP1受体;而EP1受体表达降低反馈下调COX2和mPGES-1的表达，抑制MCs的增殖和ECM的合成，从而发挥抗炎作用，减轻MCs损伤和肾脏的纤维化，因此，上述结果提示EP1可能在TGF-β1诱导的MCs损伤中发挥着重要的调节作用。

MAPKs是一组高度保守的丝氨酸/苏氨酸双重磷酸化蛋白激酶家族，它存在于大多数原核生物和所有真核生物中，在细胞生物信号传导中起着非常重要的作用。MAPKs家族主要包括ERK、p38MAPK和JNK，介导细胞生长、发育、分化及死亡及细胞间的功能同步等多种生理过程［16］。p38MAPK是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一，且有研究表明p38MAPK主要通过引起细胞增殖、肥大或凋亡在早期肾脏发育中起重要作用。有研究表明，在TGF-β1诱导的大鼠肾小球MCs，EP1参与的细胞增殖是通过ERK/MARK激酶途径实现的［17］。我们的研究发现EP1受体沉默可显著抑制TGF-β1诱导的ERK、P38磷酸化;这一结果提示TGF-β1诱导的细胞增殖及胞外基质聚积可能部分与EP1介导的ERK和P38磷酸化有关。

结合我们目前的实验结果，我们认为沉默EP1受体可以抑制ERK、P38信号通路，从而抑制激酶级联的下游靶位，比如FN、CTGF等从而发挥抑制MCs增殖的作用，TGF-β1刺激后，PGE2的表达上调，EP1受体沉默后反馈下调COX2/mPGES-1的表达，抑制MCs的增殖和细胞外基质的合成减轻MCs损伤。这些结果提示抑制EP1受体可能作为一个治疗肾纤维化的潜在靶点，是否给慢性肾脏病的患者提供了一种新的治疗观念，则仍需在以后的研究中进一步确定。

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Role of prostaglandin E2 receptor subtype 1 on TGF-β1-induced mousem esangial cell

MAWen，XU Yuyin，QIU Zhi，FAN Yaping。CHEN Xiaolan
Department of Nephrology，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，China

CHEN Xiaolan(E-mail:chenxl8448@sina．com)

Objective:To investigate the effect and mechanisms of prostaglandin E2 receptor subtype 1(EP1)on transforming growth factor-β1(TGF-β1)-induced mousemesangial cells(MCs)．M ethodology:The primary MCs were generated．Three siRNAswere designed and synthesized．One of them thatwas capable of silencing EP1most effectively in MCs．They were divided into five cell groups:(1)control group;(2)TGF-β1(10 ng/ml)group;(3)NC-siRNA+TGF-β1(10 ng/ml)group;(4)EP1-siRNA+TGF－β1(10 ng/m l)group;(5)EP1-siRNA group．The expression of PGE2 in cell supernatant of each group was detected by using ELISA，themRNA expression of fibronectin(FN)，connective tissue growth factor(CTGF)，cyclooxygenase-2(COX2)，and mPGES-1 of each group was determined by using Real-Time PCR，and the proteins of FN，CTGF，COX2，mPGES-1 and the variation of phosphorylation proteins relating to MAPKs signaling pathway，such as p38，ERK，were examined by using Western blot．Results:Compared with normal control group，mRNA and protein expressions of FN，CTGF，COX-2 andmPGES-1 were up-regulated in group 2(TGF-β1 group) (P＜0.05)．Compared with group 2(TGF-β1 group)，the expressions of FN，CTGF，COX-2 and mPGES-1 mRNA and proteinswere down-regulated in group 4(EP1-siRNA+TGF-β1 group)(P＜0.05)．The silencing EP1 also declined TGF-β1-induced p38 and ERK phosphorylation(P＜0.05)．Conclusion:EP1-siRNA may mitigate the damage of TGF-β1 induced MCs by inhabiting p38 and ERK1/2 phosphorylation．

prostaglandin E2 receptor subtype 1 siRNA transforming growth factorβ1 mesangial cells signaling pathway

2014-07-14

(本文编辑 青松春 江加则)

国家自然科学基金(81170656)，南通市科技项目(HS2011021)，南通大学研究生科技创新计划项目(YKC13078)［作者单位］江苏南通大学附属医院肾内科(南通，226001)

陈晓岚(E-mail:chenxl8448@sina．com)

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