转化生长因子β1通过Smad3调控补体应答基因32转录的分子机制

沈云琳 钮小玲 刘华杰 孙 蕾 匡新宇 黄文彦



转化生长因子β1通过Smad3调控补体应答基因32转录的分子机制

沈云琳 钮小玲 刘华杰 孙 蕾 匡新宇 黄文彦

目的：前期工作发现补体应答基因32(RGC-32)是转化生长因子β(TGF-β)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转化(EMT)过程中Smad信号下游的关键调控分子。本研究拟进一步明确TGF-β诱导肾小管EMT过程中RGC-32的转录调控机制。 方法：体外培养NRK-52E细胞，利用荧光素酶报告基因实验检测RGC-32启动子活性以确定Smad结合元件(SBE)是否为TGF-β诱导的RGC-32转录调控位点；通过凝胶迁移率实验(EMSA)明确与之结合的转录调控分子。 结果：(1)转染野生型SBE片段的NRK-52E细胞荧光素酶活性明显增高，而转染突变的SBE片段的细胞无此表现，表明SBE是调控TGF-β诱导的RGC-32转录启动的关键位点。(2)合成32P标记的包含SBE的寡核苷酸探针行EMSA可见TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成，且加入包含SBE序列的竞争片段可以抑制此核蛋白-探针复合物的形成，表明有蛋白与SBE结合并调控RGC-32的转录。(3)当加入不同的Smad抗体行超迁移实验发现Smad2和Smad3抗体可以和复合物相互作用，表明Smad2和Smad3可能是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分。(4)将Smad2和Smad3分别与p-1500RGCluc共同转染NRK-52E细胞，Smad3可以显著增加RGC-32启动子活性，表明Smad3是TGF-β诱导的转录复合物的组成部分，而不是Smad2。 结论：在TGF-β诱导肾小管EMT过程中，Smad3通过与RGC-32启动子区SBE结合，从而调控肾小管EMT过程。

补体应答基因32 上皮-间充质转化 转化生长因子β 转录调控

慢性肾脏病(CKD)一直是困扰全世界的难题，并严重威胁着人类健康。而肾小管间质纤维化的程度与肾功能下降及CKD的进程密切相关[1-3]。肾小管间质纤维化的一个重要过程是上皮细胞-间充质转化(EMT)[3-5]，主要表现为上皮细胞的表型和功能丢失，上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白表达降低，而间质细胞标志物如N-钙黏蛋白表达增强，并且获得产生细胞外基质(ECM)的能力，如胶原蛋白，纤维连接蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达增加[6-7]。现已明确转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路在肾小管EMT过程中起关键作用，而Smad蛋白是TGF-β信号转导通路中将信号由胞质转导至细胞核的中介分子[8]。然而，TGF-β诱导EMT的详细分子调控机制尚有待进一步阐明。我们先前的研究发现，补体应答基因32(RGC-32)作为TGF-β下游关键调控分子，参与了Smad信号通路介导的肾小管上皮细胞EMT过程[9]。在TGF-β诱导的神经嵴细胞平滑肌细胞分化中，Smad2和PEA3相互作用共同调节RGC-32的转录活性[10]。最近，Guo等[11]发现RGC-32必须与Smad3相互作用诱导人肾小管细胞EMT。但Smad3调控RGC-32的分子机制尚有待明确，为此，本研究通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)明确Smad3调控RGC-32转录的分子机制。

材料和方法

细胞培养和试剂 大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)细胞株购自ATCC(American Type Culture Collection)。细胞培养用含5%胎牛血清(GIBCO公司)Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基(GIBCO公司)，37 ℃，95%空气和5%二氧化碳细胞培养箱培养。将NRK-52E细胞按3×105/孔接种至六孔板中培养至80%融合，换无血清DMEM培养基培养6h，然后按实验需要予TGF-β1(5 ng/ml)刺激不同时间后收集细胞用于检测。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5抗体(兔多抗IgG)购自Santa Cruz公司。Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表达质粒[12]及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)均购自于OriGene公司。TGF-β1来源于R&D Systems公司。

RGC-32启动子质粒构建 参照文献10,即利用大鼠基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增RGC-32启动子DNA，并克隆至经KpnI/Bgl II限制性内切酶消化的含荧光素酶报告载体pGL3-basic(Promega)位点之间。pGL3-RGC-32(-1 500)所包含的调控区域位于RGC-32基因-1 500 bp至22 bp处。引物设计为：正向：5>A￣A￣A￣A￣G￣G￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣T￣C￣T￣G￣A￣C￣A￣C￣C<3；反向：5>A￣A￣A￣A￣A￣G￣A￣T￣C￣T￣C￣G￣C￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣C￣T￣C￣G￣C￣G￣T￣G￣A￣G<3。pGL3-RGC-32(-1 500)突变质粒采用Quikchange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit突变试剂盒(Stratagene 公司)构建，按试剂盒说明书使用。Smad结合位点(SBE)序列为GTCTGGAC(-1 344 bp至-1 337 bp)突变为GTtatGAC。

转染和荧光素酶报告基因实验 将NRK-52E细胞以2×105/孔接种于12孔板中培养至细胞80%融合，然后严格按照说明书用LipofectAMINE 2000转染细胞，所有样品均设三个复孔。50%的转染细胞观察到有增强的绿色荧光蛋白质粒转染。用荧光酶标仪(BioTek instruments)检测荧光素酶活性。实验均重复5次，结果取均值。

凝胶迁移率(EMSA)实验 首先提取NRK-52E细胞核蛋白，并测定浓度，然后标记寡核苷酸探针。EMSA实验方法[10,13]如下：(1)结合反应：将DNA结合反应液15 μl和核蛋白提取物5 μg加入EP管内冰浴15 min，加入已标记的寡核苷酸双链1 μl，25℃孵育30 min，加入4 μl加样缓冲液，混匀后加样。(2)特异性竞争抑制实验：将DNA结合反应液15 μl和核蛋白提取物5 μg加入EP管内冰浴15 min，加入50倍未标记的同样的寡核苷酸双链，25℃孵育20 min，加入已标记的寡核苷酸双链1 μl，25℃孵育30 min，加入4 μl加样缓冲液，混匀后加样。(3)超迁移实验：在结合反应的基础上再加入了1 μg Smad抗体，25℃孵育30 min，加入4 μl加样缓冲液，混匀后加样。蛋白-DNA 复合物用5%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离并行放射自显影。突变探针的突变位点与之前突变荧光素酶质粒的描述相同。

统计学分析 结果采用SPSS 10.0统计软件包进行统计，所有数值均用均值±标准差表示。数据分析两组间比较采用ANOVA，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

TGF-β诱导RGC-32转录调控位点的验证 SBE序列为GTCTGGAC，位于RGC-32基因转录起始位点上游-1 344 bp至-1 337 bp。Huang等[10]报道，在神经嵴细胞向平滑肌细胞分化过程中，Smad2和PEA3共同作用调控RGC-32的转录，而SBE为RGC-32转录调控的结合位点。为了验证SBE是否在TGF-β诱导的肾小管上皮NRK-52E细胞RGC-32转录中同样起调控作用，我们设计了pGL3-RGC-32(-1 500)序列的部分核苷酸突变位点(图1A)，然后将野生型和突变序列分别转染至NRK-52E细胞，TGF-β1刺激后行荧光素酶活性测定。结果发现突变的SBE较野生型的荧光素酶活性明显降低(图1B)，表明SBE是TGF-β诱导的RGC-32转录的调控位点。

图1 TGF-β诱导RGC-32转录调控位点的验证SBE：Smad结合元件；TGF-β:转化生长因子β;RGC-32:补体应答基因32；A：RGC-32基因转录起始位点上游-1 500 bp至-1 021 bp中包含SBE序列，野生型中下划线部分为野生型SBE序列，而突变型中下划线部分为突变的SBE序列，图中数字为RGC-32基因转录起始位点上游相应碱基数;B：将野生型和突变型转染NRK-52E细胞20h，然后细胞用TGF-β1(5 ng/ml)刺激18h后测定荧光素酶活性；*：与空白载体组比较，P<0.05

TGF-β诱导的核蛋白与SBE结合形成复合物 为了观察TGF-β诱导的核蛋白与SBE相互作用，TGF-β1刺激NRK-52E细胞后，将核蛋白提取物与32P标记的包含SBE的DNA寡核苷酸探针孵育，然后行EMSA。结果发现，TGF-β1刺激后30 min、2 h和6 h均存在TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成(图2A)。当加入包含SBE的野生型DNA序列的竞争片段可抑制此核蛋白-探针复合物的形成，而加入包含突变的SBE序列的竞争片段则没有此作用(图2B)。

图2 TGF-β诱导的核蛋白与SBE结合形成复合物TGF-β:转化生长因子β;SBE:Smad结合元件；EMSA：凝胶迁移率试验；A:NRK-52E细胞用TGF-β(5 ng/ml)刺激后，其核蛋白提取物与32P标记的SBE探针孵育，行EMSA结果;B:在核蛋白提取物与探针孵育时，再加入包含野生型SBE的DNA片段或包含突变SBE的DNA片段作为竞争物，行竞争性EMSA实验

TGF-β诱导的与SBE结合的核蛋白 上述实验证明有TGF-β诱导的核蛋白与探针复合物生成，但仍不清楚蛋白质性质。于是我们在上述实验的基础上又分别加入不同的Smad抗体行超迁移实验，以了解Smad蛋白是否是TGF-β诱导的核蛋白-探针复合物的组成成分。通过超迁移实验发现，加入Smad2或Smad3抗体的转录复合物出现迁移延迟，但Smad1、Smad4 和Smad5抗体则没有，表明Smad2和Smad3抗体可以和复合物相互作用，可能是TGF-β诱导的转录复合物的组成成分。

图3 TGF-β诱导的与SBE结合的核蛋白TGF-β:转化生长因子β;SBE:Smad结合元件；EMSA：凝胶迁移率试验；在上述EMSA实验基础上，将核蛋白提取物与1.0 μg的Smad1(S1)、Smad2(S2)、Smad3(S3)、Smad4(S4)和Smad5(S5)放在冰上孵育0.5 h，用正常羊IgG作为对照(C)，然后行超迁移EMSA，观察转录复合物有无迁移延迟

Smad3是TGF-β诱导RGC-32转录活性的关键分子 以上实验可以明确Smad2和(或)Smad3参与了TGF-β诱导RGC-32启动的复合物的组成，但是何种Smad是RGC-32转录启动的关键我们还不清楚。我们将pGL3-RGC-32(-1 500)质粒和Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表达质粒共同转染到NRK-52E细胞，然后用TGF-β刺激。荧光素酶报告基因测定显示Smad1和Smad5对RGC-32转录活性没有影响，但Smad2、Smad3和Smad4明显上调RGC-32转录活性(图4A)；而当转染不同的Smad siRNA后，转染Smad3 siRNA的细胞RGC-32转录活性下降(图4B)。将Smad2和Smad3表达质粒分别或一起与RGC-32(-1 500)质粒共同转染NRK-52E细胞后发现，转染Smad3后RGC-32的转录活性明显上调(图4C)。

图4 Smad3是TGF-β诱导RGC-32转录活性的关键分子TGF-β:转化生长因子β;RCG-32：补体应答基因32；A:将RGC-32(-1 500)质粒分别与Smad1、Smad2、Smad3、Smad4和Smad5表达质粒共同转染NRK-52E细胞20h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)或TGF-β1(-)刺激18h，测定荧光素酶活性;B：将RGC-32(-1 500)质粒分别与Smads siRNA (Smad-S)或对照(siCtrl)共同转染NRK-52E细胞48h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)刺激18h，测定荧光素酶活性；C：将Smad2和Smad3表达质粒分别或一起与RGC-32(-1 500)共同转染NRK-52E细胞20h，然后用TGF-β1(5 ng/ml)或TGF-β1(-)刺激18h，测定荧光素酶活性；*：与TGF-β1(-)组比较，P<0.05

讨 论

TGF-β是转化生长因子超家族中的主要成员，可以通过受体表面的受体信号转导途径调节细胞的增殖、分化和凋亡，对细胞外基质的合成、创伤的修复、免疫功能等有重要的调节作用。在CKD中TGF-β是肾小子，TGF-β信号的转导分为Smad通路和非Smad通路。许多研究已经揭示，TGF-β信号通路和Smad蛋白包括Smad2、Smad3、Smad4和Smad7，在肾脏纤[12，14-15]。TGF-β配体和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Ⅱ型受体结合并使其活化，活化的Ⅱ型受体募集并结合Ⅰ型受体，形成异源三聚体，使Ⅰ型受体磷酸化，活化的Ⅰ型受体特异性地与Smad蛋白相互作用，并将信号转入细胞核[16]。

Smad蛋白可分为三类，分别为受体激活型Smad(Smad2和Smad3)、公共介体型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad7)。活化的Ⅰ型受体特异性地与受体激活型Smad2和Smad3相互作用使其活化，活化的Smad2/3还必须与公共介体型Smad4结合，Smad4协助活化的Smad2/3向核内转移，并保持其转录活性，转入核内的Smad2/3通过与DNA结合或与其他转录因子共同作用而参与转录调节[8，16-17]。目前认为Smad2/3是肾脏纤维化时TGF-β1诱导的EMT过程中必需的[18]，但是具体的机制仍不清楚。

RGC-32是一种重要的补体应答基因，首次由Badea等[19]克隆，被发现存在于多种人类组织中，包括心、脑、肝、骨骼肌、胎盘、肾脏和胰腺。在人类某些肿瘤组织中，如结肠癌组织中，RGC-32表达明显增高[20]。RGC-32还是周期素依赖激酶p34cdc2的调控分子，对细胞周期的激活起到重要作用[19,21]。我们前期研究发现RGC-32作为TGF-β下游Smad信号通路关键调控分子参与了TGF-β诱导的肾小管细胞EMT[9]。Verrecchia等[22]报道某些纤维发生基因(胶原蛋白)和EMT标志物(α-SMA和E-cadherin)依赖于Smad3。最近，Guo等[11]研究发现，RGC-32必须与Smad3相互作用并调控成纤维细胞标志物α-SMA、ECM和E-cadherin的表达。然而，Smad3如何调控RGC-32的分子机制仍不清楚。

本研究中，我们首次阐明在TGF-β诱导NRK-52E细胞EMT过程中，Smad3调控RGC-32基因转录活性。首先，通过荧光素酶报告基因实验和EMSA实验证实RGC-32基因启动子区上游的SBE序列(-1 344至-1 337 bp)为TGF-β诱导的核蛋白与RGC-32启动子相互作用的结合位点。第二，通过特异性抗体的识别发现，Smad2和Smad3抗体可以与TGF-β诱导的与RGC-32启动子结合的转录因子复合物结合，因此Smad2/3可能是复合物的组成成分。由于Smad4是公共介体型Smad，其可协助活化的Smad2/3向核内转移，其本身不是复合物的组成成分，故无超迁移条带产生。第三，荧光素酶基因报告实验显示，Smad3明显增强RGC-32启动子活性，但Smad1、Smad2和Smad5对RGC-32启动子活性没有影响，故Smad3可能是TGF-β诱导的RGC-32启动子活化的关键分子。第四，将Smad2和Smad3表达质粒分别或一起与p-1500RGCluc共同转染NRK-52E细胞，Smad3明显增强RGC-32启动子活性，而Smad3 siRNA可抑制RGC32启动子活性。以上结果表明，在TGF-β诱导的NRK-52E细胞EMT过程中，Smad3可通过与RGC-32基因启动子区上游的SBE序列结合，对RGC-32的转录调控起到重要作用。

图5 TGF-β1通过Smad3调控RGC-32转录示意图TGF-β：转化生长因子β；RGC-32：补体应答基因32；SBE：Smad结合元件；TβR：转化生长因子β受体

现已明确，TGF-β/Smad信号转导通路在EMT过程中起着关键作用，Smad2和Smad3在Smad4的协助下，将TGF-β信号从细胞表面传导至细胞核，从而调控相关基因转录最终发挥其生物学作用[23]。前期工作表明RGC-32为Smads下游关键调节分子在EMT过程中起重要作用[9]，但其确切分子调控机制不明。Huang等[10]研究发现RGC-32转录调控在TGF-β诱导神经嵴细胞株Monc-1细胞向平滑肌细胞分化过程中起着重要作用，且Smad2与PEA3相互作用调控RGC-32转录水平。本研究通过体外NRK-52E细胞，进一步发现TGF-β诱导EMT过程中，TGF-β通过Smad3(并非Smad2或Smad4)与RGC-32基因上游SBE序列结合，从而调控RGC-32基因转录活性。结合Guo等[11]新近研究发现TGF-β诱导人近端肾小管细胞株(HPTC细胞)EMT过程中，Smad3必须与RGC-32蛋白结合由细胞浆跨膜进入细胞核，从而调控α-SMA、ECM和E-钙黏蛋白的表达。因此，我们推测RGC-32在TGF-β诱导EMT过程中的作用机制如图5所示，即一方面TGF-β信号通过Smads转导过程中细胞质内Smad2/Smad3/Smad4形成复合物，RGC-32蛋白与Smad3结合该复合物转入细胞核内，从而发挥作用；另一方面，Smad3与RGC-32启动子区SBE结合进一步调控RGC-32转录活性。

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(本文编辑 加 则 青 松)

The molecular mechanism of TGF-β1 regulating trascription of response gene to complement 32 through Smad3 pathways

SHENYunlin,NIUXiaoling,LIUHuajie,SUNLei,KUANGXinyu,HUANGWenyan

DepartmentofNephrologyandRheumatology,ShanghaiChildren’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200062,ChinaCorrespondingauthor:HUANGWenyan(E-mail:hwy65@hotmail.com)

Objective：To research the molecular mechanisms of Smad3 regulation RGC-32 transcription in TGF-β1 induced Epithelial-mesenchymal Transition on NRK-52E Cells. Methodology：The NRK-52E cells were cultured and transiently transfected in vitro. Luciferase assays were performed to determine whether the SBE plays roles in TGF-β1-induced RGC-32 promoter activation. Electrophoretic mo to determine which proteins are the formations of TGF-β1-induced nuclear complex. Results：(1) The Smad biGF-β1-induced RGC-32 transcriptional activation. The SBE mutation structure significantly inhibited RGC-32 promoter activity. (2) The SBE was essential for the interaction of TGF-β1-induced nuclear proteins with RGC-32 promoter. It was found that the TGF-β-induced interaction between nuclear factors and RGC-32 promoter in EMSA, and the wild-type DNA containing SBE site as competitors abolished the formation of TGF-β-induced complex. (3) Smad2/3 was the composition of TGF-β1-inducible transcription factor complex bound to RGC-32 promoter as recognized by their specific antibodies in EMSA. (4) Smad2 and Smad3 expression plasmids were co-transfected individually into NRK-52E cells, and then Smad3 significantly increased the RGC-32 promoter activity. This suggests that Smad3, but not Smad2, be presented in the TGF-β1-inducible complex formed by nuclear proteins with RGC-32 promoter. Conclusion：These results illuminated that Smad3 may be combined with RGC-32 promoter region SBE and play an important role in transcriptional regulation in TGF-β-induced renal tubular EMT of NRK-52E cells.

response gene to complement 32 epithelial-mesenchymal transition transforming growth factor-β transcriptional regulation

国家自然科学基金资助项目(81370813)；上海市科委(114119a1700)；上海市卫生局优秀学科带头人项目(XBR2011010)

上海交通大学附属儿童医院肾脏风湿科(上海,200062)

黄文彦(E-mail：hwy65@hotmail.com)

2015-02-26

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