银杏内酯B前体药物的脑靶向性研究

朱世璟，袁 媛,2，尹华阳，惠爱玲，周 安，潘 见

(1.合肥工业大学天然药物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034; 3.安徽中医药大学，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230038)

银杏内酯B前体药物的脑靶向性研究

朱世璟1，袁 媛1,2，尹华阳1，惠爱玲1，周 安3，潘 见1

(1.合肥工业大学天然药物研究所，安徽 合肥 230009；2.沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034; 3.安徽中医药大学，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230038)

目的 考察银杏内酯B前体药物(PGB)的脑靶向性，并探究其靶向机制。方法 采用LC-MS/MS考察大鼠尾静脉注射PGB后的脑部药动学规律并评价其脑靶向性；采用伊文斯蓝法观察PGB对不完全性脑缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响；HPLC法测定PGB在正辛醇-水体系的分配系数(logP)；MVD分子对接软件计算PGB与P-糖蛋白(P-gp)的体外结合力；定磷法检测PGB对人P-gp膜ATP酶活性的影响。结果 以治疗有效性和靶向指数评价PGB的脑靶向效率达6.87和4.14；PGB预防给药可有效降低不完全性脑缺血小鼠的脑毛细血管通透性(P<0.05)；PGB的 logP为1.03，高于GB的0.61；分子对接计算表明PGB与P-gp结合力大于GB，其MolDockScore分别为-143.36、-116.40 KJ·mol-1；ATP酶活性分析提示PGB、GB均能提高P-gp ATP酶活性，其Km值分别为237.75、841.24 μmol·L-1, PGB与P-gp亲和力高于GB。结论 PGB具有脑靶向性，其靶向性提高一方面得益于其脂溶性提高，PGB在脑部渗透量增加；另一方面可能为PGB明显提高P-gp ATP 酶活性，从而抑制P-gp对GB的外排作用。

银杏内酯B；前体药物；脑靶向；脑缺血；脂水分配系数；P-糖蛋白；ATP酶活性

银杏叶提取物(ginkgo biloba extract, GBE)是临床治疗脑血管疾病的一线药物，疗效得到国内外医学界充分肯定。银杏内酯B(ginkgolide B, GB)是GBE中重要的活性成分之一，GB是血小板活化因子(platelet activation factor, PAF)受体最有效的拮抗剂[1]，它可减轻脑缺血/再灌注介导的脑组织脂质过氧化反应，提高自由基清除系统酶的活性，对脑损伤有明显保护作用[2-3]。

然而，GB的药代研究数据发现其在脑部浓度非常低[4-5]，如：尾静脉注射GB (10 mg·kg-1) 20 min后脑部浓度仅为0.24 μg·g-1[4]。这里除了脑细胞对GB的清除效应外，其血脑屏障(blood brain barrier, BBB)对药物的屏障作用及BBB上P-糖蛋白(p-glycoprotein, P-gp)对药物的外排作用亦不容忽视[6]。因此，本实验室以提高GB脑靶向性、增强药效为目的，设计合成了一系列GB脑靶向前药[7-8]，如酯类前药PGB(Fig 1)，它是在GB的10位羟基位置引入另一分子T而得到。T具有钙离子拮抗作用，同时对P-gp也具有一定的抑制作用。前期研究结果证实：PGB保留GB的抗血小板聚集活性[9]，同时增加了拮抗钙离子通道蛋白的作用[7]。

PGB是作用于脑部而发挥药效的药物，所以对其脑靶向性评价及对脑缺血的保护作用研究尤为重要。为此，本文采用LC-MS/MS法，考察大鼠尾静脉注射PGB后的脑部药动学规律并评价其脑靶向性；采用颈动脉结扎致小鼠不完全性脑缺血模型，通过伊文斯蓝法考察PGB对缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响。在证实PGB具有脑靶向作用的基础上，深入探究其靶向机制将为其它药物的脑靶向前药设计提供科学指导。

理论上来说，BBB通透性增加及P-gp外排功能减弱均有利于增加PGB的脑部浓度，从而提高其脑靶向效率。为此，我们采用摇瓶法，结合HPLC测定PGB在正辛醇-水体系的脂水分配系数(logP)，以此推测PGB的BBB通透性。P-gp结合力(亲和力)大小直接影响P-gp外排功能的强弱，在此，我们分别采用Molegro Virtual Docker (MVD)分子对接软件计算PGB、GB与P-gp的结合力大小；并以ATPase活性分析法测定PGB、GB对人P-gp膜ATP酶活性的影响，以考察它们与P-gp的亲和力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 PGB为本实验室合成，其结构经IR、NMR、MS确证，纯度>99%；GB为合肥拓峰生物工程有限公司提供，纯度≥ 98%；盐酸维拉帕米为武汉拉那白医药化工有限公司提供，纯度99%；HPLC级甲醇购自美国Tedai公司；伊文斯蓝购自BIOSHARP公司；人P-gp膜购自美国BD公司；Tris、MES、DL-二硫苏糖醇(DTT)购自萨恩(上海)化学技术有限公司；甲酰胺、正钒酸钠、Mg-ATP、消泡剂A、SDS购自美国Sigma公司；其它试剂购自国药集团，均为分析纯。

1.1.2 仪器 API 3200型三重四级杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司；高效液相色谱系统，配有515高压泵、2420蒸发光散射检测器(ELSD)、2487紫外光谱检测器(UVD)、Empower数据处理系统，美国Waters公司；Spectra Max M2e 多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；标准PB-10酸度计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；台式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；96孔细胞培养板，美国Corning公司。

1.1.3 实验动物 SD大鼠，♀♂兼用，体质量(200±20)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(皖)2005-001；SPF级昆明种小鼠，♂，体质量(20±2)g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(皖)2011-002。动物自由进食，饮水，标准颗粒饲料，室温(18～22)℃，实验前常规饲养1周。

1.2 方法

1.2.1 PGB脑靶向性评价

1.2.1.1 动物分组及给药 SD大鼠随机分为PGB组(12.83 mg·kg-1)或GB组(10 mg·kg-1)，尾静脉注射给药，于给药后0.08、0.17、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h时经大鼠眼底静脉丛采血，置于预先肝素化的试管中，4℃离心 (4 000 r·min-1，10 min)，精密吸取上层血浆，于-20℃保存，待测。取血后立即取出脑组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重后加入4倍量生理盐水(kg·L-1)制成脑匀浆，于-20℃保存，待测。

1.2.1.2 生物样品处理 精密吸取血浆或脑匀浆190 μl，加入GA溶液(4 mg·L-1，内标)5.0 μL，混匀后加入乙酸乙酯1.0 mL，涡旋振荡3 min，4℃离心 (12 000 r·min-1，10 min)，取上层有机相，40℃水浴氮气流下吹干，残渣用400 μL流动相复溶，离心10 min，取上清液。其中血浆样品的上清液稀释10倍，脑匀浆样品不稀释，取10 μL进行LC-MS/MS分析。

1.2.1.3 测定条件[10]色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry shield RP18 (3.9 mm×150 mm ID，5 μm)；流动相：甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵溶液(85 ∶15，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温40℃；进样量10 μL。

质谱条件：电喷雾ESI离子源；负离子模式；多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(IS)-4500 V；离子源温度(TEM)500℃；定量分析的离子对：PGB，[M-H]-，m/z 543.3/137.2；GB，[M-H]-，m/z 423.6→367.1和GA，[M-H]-，m/z 407.2→350.8。

1.2.1.4 脑靶向性评价[11]采用中国药理学会编制的3P97药代动力学分析软件，计算静脉注射药物后血浆及脑组织中的药代动力学参数，并以治疗有效性(therapeutic availability, TA)和靶向指数(drug targeting index, DTI)定量评价PGB的脑靶向特性。

式中：AUC表示药物从零时间至所有原形药物全部消除这一段时间的药-时曲线下面积。

AUCbrain(PGB)、AUCbrain(GB)分别表示注射PGB和原药GB后的脑内GB的AUC。

AUCblood(PGB)、AUCblood(GB)分别表示注射PGB和原药GB后的血浆内GB的AUC。

1.2.2 PGB对不完全性脑缺血模型小鼠脑毛细管通透性的影响 SPF级小鼠按体质量均衡随机分为假手术组、模型组、GB组(5 mg·kg-1)、PGB高、中、低剂量(10、5、2.5 mg·kg-1)组。除假手术组、模型组外，其余各组均腹腔注射给药，给药容积为5 mL·kg-1，假手术组、模型组给予等容积的溶媒，每3 d称量体质量1次，根据体质量变化调整给药容量，连续腹腔注射7 d。

d 8各组小鼠用5.25%水合氯醛溶液麻醉，手术分离两侧颈总动脉，用动脉夹持续夹闭双侧颈总动脉20 min，打开双侧动脉夹，缝合颈部皮肤。休息2 h后由尾静脉注射2.5% 伊文斯蓝溶液 (10 mL·kg-1)。注射1 h后，将小鼠颈椎脱臼处死，开颅取脑，将脑组织浸于生理盐水中清洗，滤纸吸干，准确称重，将脑组织浸泡于脑质量10倍体积(kg·L-1)的甲酰胺中， 45℃培养箱温育72 h，12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，于620 nm处，酶标仪测光密度(OD)值。

1.2.3 PGB脂水分配系数测定[12]

1.2.3.1 测定条件 色谱柱：Symmetry shied C18柱(250×4.6 mm, 5 μm)；测定GB时的其它色谱条件：流动相：甲醇-水-四氢呋喃(30 ∶60 ∶10，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25℃；蒸发光散射检测器，氮气25 psi，增益值100，漂移管60℃，蒸发器级别60%。

测定PGB时的其它色谱条件：流动相：甲醇-水(55 ∶45，V/V)；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25℃；紫外检测波长275 nm。进样量均为10 μL。

1.2.3.2 样品配制 精密配制浓度为1.0及 0.1 g·L-1的PGB、GB正辛醇(二次蒸馏水饱和)溶液，避光保存，备用。

1.2.3.3 平衡时间确定 分别取0.1、1.0 g·L-1PGB正辛醇溶液10 mL于锥形瓶中，加入10 mL二次蒸馏水(正辛醇饱和)混合振荡。分别振荡1、2、3、4、5、6 h后，分离水相和有机相，检测水相中PGB浓度。当浓度不再增加时，即为平衡时间。同法确定GB正辛醇溶液的平衡时间。

1.2.3.4 脂水分配系数测定 分别取0.1 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL与10 mL二次蒸馏水(1 ∶1)混合，25℃下振荡3 h (根据1.2.3.3结果确定)；另取1.0 g·L-1PGB或GB正辛醇溶液10 mL与50 mL二次蒸馏水(1 ∶5)混合，25℃下振荡5 h(根据1.2.3.3结果确定)。上述各溶液振荡后分离有机相和水相，分别测定两相中PGB、GB浓度。

正辛醇/水分配系数以log P表示，其计算公式为：

式中：Co表示化合物在正辛醇中的浓度，Cw表示化合物在水相中的浓度。

1.2.4 PGB与P-gp结合力的分子对接计算[13]采用MVD软件模拟配体分子与受体蛋白的结合力或亲和力。这里的受体蛋白为P-gp，它的晶体结构[14]来源于蛋白质数据库(protein data bank, PDB)的鼠P-gp PDB code：3G5U)；配体分子选择PGB、GB、T 和维拉帕米(verapamil, Ver)。T分子是PGB结构(Fig 1)中具有P-gp抑制作用的活性分子；Ver是一种常用的P-gp抑制剂，可激活P-gp的ATP酶活性。在分子对接过程中，采用准确性较高的MolDock打分算法，MolDock Score 绝对值越大，配体分子与P-gp结合力越大。结合力越大，越易被P-gp外排，从而可以使同时存在的其它分子的外排受到抑制。

Fig 1 Chemical structures of GB and PGB

1.2.5 PGB对人P-gp 膜ATP酶活性的影响[15-16]

1.2.5.1 溶液配制 反应基质液：称取EGTA 75.8 mg、KCl 187.3 mg、DTT 31.2 mg、NaN332.5 mg溶于100 mL Tris-MES 缓冲液(PH 6.8)得到反应基质液。

标准Pi溶液：称取NaH2PO430.0 mg溶于10 mL反应基质液得到3 g·L-1的NaH2PO4储备液。用反应基质液稀释至0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05 g·L-1，即为标准Pi溶液。

药物溶液：(1) PGB或GB溶液：分别称取8.2 mg PGB 或6.4 mg GB，用反应基质液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的PGB或GB母液，并稀释至750、300、150、30 μmol·L-1；(2) Ver溶液：称取7.4 mg盐酸维拉帕米，用反应基质液溶解并定容至10 mL，配成1 500 μmol·L-1的Ver母液，并稀释至750、300、150、30 μmol·L-1。

P-gp膜溶液：取人P-gp膜母液 (5 g·L-1)于37℃水浴快速解冻，用反应基质液稀释至1 g·L-1，置于冰上待用。

正钒酸钠工作液：称取正钒酸钠27.5 mg溶于5 mL反应基质液，取其中的100 μL溶液用反应基质液稀释至10 mL，得到300 μmol·L-1的正钒酸钠工作液。

Mg-ATP液：称取Mg-ATP 31.2 mg，溶于5 mL反应基质液，得到12 mmol·L-1的Mg-ATP溶液。

反应终止液和显色液：称取SDS 1.01g溶于10 mL蒸馏水，加入20 μL消泡剂A，配成SDS质量分数为10%含0.2%消泡剂A的反应终止液；称取钼酸铵432.6 mg、醋酸锌27.5 mg，用蒸馏水溶解并定容至10 mL得到显色剂A。称取抗坏血酸4 g，溶于36 mL蒸馏水，配成质量分数为10%抗坏血酸溶液，此为显色剂B。使用时两种溶液以1 ∶4 (V/V)混合作为显色剂。

1.2.5.2 试验分组 非P-gp ATP酶活性组(正钒酸钠+P-gp膜)；阳性对照组(Ver系列浓度+P-gp膜)；试验组(GB或PGB系列浓度+P-gp膜)。

1.2.5.3 反应孵育条件 反应在96孔板中进行。P-gp膜溶液和试验药物溶液各20 μL，在37℃培养箱中预热5 min，随后加入20 μL 37℃预热5 min的Mg-ATP溶液，开始反应。另将含有正钒酸钠的反应液作为对照，以排除P-gp制作过程中非P-gp ATP酶活性和非酶作用的ATP水解的影响。该反应液(60 μL)在37℃孵育相应时间，之后每孔加入30 μL反应终止液，再加入200 μL显色剂(含40 μL显色剂A和160 μL显色剂B)，37℃孵育20 min，多功能酶标仪在620 nm处测吸光度。

1.2.5.4 Pi标准曲线 将配制好的0～0.3 g·L-1标准Pi溶液接种于96孔板上，每孔60 μL，每个浓度平行5孔，37℃孵育30 min后，加入30 μL反应终止液，其余按1.2.5.3项下处理。

1.2.5.5 时间-ATP酶活性实验 根据试验分组，分别在96孔板中加入正钒酸钠工作液、300 μmol·L-1Ver溶液、300 μmol·L-1GB溶液或PGB溶液各20 μL，每组平行3孔。随后每孔加入稀释后的P-gp膜溶液20 μL，37℃培养箱中预热5 min，最后加入37℃预热的Mg-ATP溶液20 μL，混匀后37 ℃分别孵育0、15、30、45、60 min。其余按1.2.5.3处理。根据Pi标准曲线求算反应释放的无机磷量，绘制ATP酶活-时间曲线。

1.2.5.6 浓度-ATP酶活性实验 根据试验分组，分别在96孔板中分别加入正钒酸钠工作液、Ver、GB、PGB系列工作液(1500、750、300、150、30 μmol·L-1)各20 μL，每一浓度平行3孔。随后每孔加入稀释后的P-gp膜溶液20 μL，在37℃培养箱中预热5 min，再加入37℃预热的Mg-ATP溶液20 μL，混匀后37℃孵育60 min(根据1.2.5.5结果确定)，之后按1.2.5.3处理。根据Pi标准曲线求算反应释放的无机磷量，绘制ATP酶活-药物浓度曲线。

1.2.5.7 数据处理 将所测得的ATP酶活性数据代入米氏方程

其中，V和Vmax分别为药物激活的ATP酶活性及其最大值，Km为米氏常数，即ATP酶活为最大值一半时的底物浓度；C代表底物浓度。

2 结果

2.1 PGB脑靶向性评价大鼠尾静脉注射PGB，给药5 min后在脑匀浆中即检测到PGB以及PGB降解的GB。与直接注射GB(以GB0表示)相比，注射PGB后在脑匀浆检测到的GB(以GB(PGB)表示)浓度均有较大幅度提高。注射PGB或GB后，在血浆和脑匀浆检测到的药物浓度数据以及它们的药动学参数列于Tab 1和2。由“1.2.1.4”下的公式计算TA为6.87，DTI为4.14，这表明将GB改造成PGB后，PGB可以迅速通过BBB，且脑靶向性大大提高。同时，我们也观察到PGB降解GB的脑内半衰期(T1/2)延长，清除率(CL)下降，PGB呈现出一种长效缓释特性，这对于脑血管疾病的长期用药是非常有利的。

Tab 1 Concentrations of drugs in rat plasma and brain tissue afterintravenous administration of PGB and GB ±s，n=6)

2.2 PGB对不完全性脑缺血模型小鼠脑毛细管通透性的影响小鼠腹腔注射连续给药7d后，模型组与假手术组相比，伊文斯蓝通过小鼠脑毛细血管的量明显增加，这说明不完全性脑缺血小鼠模型复制成功(P<0.05)，如Tab 3所示。GB给药组的伊文斯蓝透过量与模型组相比有所减少，但其差异无统计学意义；而PGB低、中、高剂量组的伊文斯蓝透过量均低于模型组，且呈现一定的剂量依赖性，其中PGB高剂量组的降低程度最为明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，PGB对不完全性脑缺血小鼠的保护作用强于GB，这可能也得益于PGB的脑靶向性提高。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of drugs in rat plasma and brain tissue

Tab 3 Cerebral capillary permeabilityin cerebral ischemia ±s)

*P<0.05vsvehicle.

2.3 PGB脂水分配系数测定PGB的脂水分配系数测定结果见Tab 4。由表可知，将GB制成前药PGB后其亲脂性增强(logP=1.03)，更易穿透BBB到达脑部。

Tab 4 Lipo-hydro partition coefficient of PGB

2.4 PGB与P-gp结合力的分子对接计算各配体与P-gp的分子对接计算结果见Tab 5。由MolDock Score计分数据预测配体分子与P-gp的结合力，其结合力大小排序为：PGB >GB ≥Ver>T。PGB与P-gp结合力大于GB，即当脑内同时存在PGB和降解的GB时，PGB由于结合力大优先被外排出脑，从而减弱了P-gp对GB的外排作用，最终使GB的脑内浓度升高。

Tab 5 Docking results of drugs with P-gp

2.5 PGB对P-gp 膜ATP酶活性的影响

2.5.1 Pi浓度测定标准曲线 在0～0.2 g·L-1的浓度范围内，无机磷吸光度(A)与NaH2PO4浓度线性良好(Fig 2)，且覆盖了整个待测样本的浓度范围。

Fig 2 Standard curve of inorganic phosphate concentration

2.5.2 时间-ATP酶活性 结果显示，PGB、GB、Ver诱导的P-gp ATP酶活性存在时间依赖性。随着时间延长，各种药物依赖的ATP水解释放的无机磷量均增多，且无机磷释放量与时间之间呈现较好的线性关系(Fig 3)。为达到最大灵敏度，选择60 min作为药物与P-gp膜作用时间，此时的吸光度均在Pi浓度测定标准曲线的线性范围之内。

Fig 3 Time-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

2.5.3 浓度-ATP酶活性 结果显示，PGB、GB、Ver均能浓度依赖性地提高P-gp ATP酶活性(Fig 4)。Ver诱导的P-gp ATP酶活性明显高于PGB和GB。在30 μmol·L-1时，GB诱导的P-gp ATP酶活性略高于PGB；而当浓度增至150 μmol·L-1及以上时，PGB诱导的P-gpATP酶活性明显高于GB。

3种药物浓度达到300 μmol·L-1时，药物诱导的P-gp ATP酶活性趋于平稳。

根据米氏方程，以1/V对1/C作图计算动力学参数Vmax、Km结果见Tab 6。 PGB的Km值小于GB，提示PGB与P-gp具有更高的亲和力，这与分子对接的结合力预测结果(PGB > GB)较为吻合。若用Vmax/Km表示药物与P-gp亲和力，其顺序亦是Ver (1.48)>PGB (0.22)>GB (0.06)。

Fig 4 Concentration-dependency of substrate-induced P-gp ATPase activity as measured by inorganic phosphate released by three drugs

Tab 6 Estimated kinetic parameters for substrate-induced P-gp ATPase activity by three drugs

DrugsVmax/μmol·g-1·min-1Km/μmol·L-1Vmax/Km/min-1×10-3PGB52.08237.750.22GB53.76841.240.06Ver52.6435.481.48

3 讨论

PGB是一种兼具PAF受体拮抗和钙离子拮抗作用的新型GB前体药物，本研究证实了PGB具有较优的脑靶向性，其以治疗有效性(TA)和靶向指数(DTI)评价的脑靶向效率达6.87和4.14。

药物有无脑靶向性关键有两点：一是药物能跨越BBB大量入脑，二是入脑药物不被外排出脑。跨膜输入依赖于药物对BBB的通透性，BBB通透性通常取决于药物本身的相对分子量、脂溶性以及特定的载体或受体转运系统等。BBB上存在的P-gp外排泵，能将许多脂溶性好、易透过BBB的药物外排出脑组织，所以减少输出需降低P-gp的外排泵效能。

正辛醇-水体系的分配系数是预测药物透膜转运能力的重要指标。本研究通过摇瓶法结合HPLC测得PGB的logP数值(1.03)高于GB (0.61)，这说明将GB改造为PGB后脂溶性增强，更易于跨越BBB到达脑部，使脑内可供降解为GB的PGB量上升。这一推测在尾静脉注射PGB后GB脑内浓度检测(Tab 1)中得到了较好地证实。

P-gp 对药物外排作用具有竞争性和ATP依赖性，本实验中，我们采用了分子对接软件预测PGB、GB与P-gp的结合力，以此分析它们被P-gp外排的优先性；研究PGB、GB对人P-gpATP 酶活性的影响，以此分析它们对P-gp外排功能的抑制作用。分子对接计算结果提示，PGB与P-gp的结合力高于GB； PGB、GB对人P-gp膜 ATP酶活的测定结果表明：二者均能提高P-gp ATP酶活，阻断P-gp介导的其它药物外排，但PGB比GB具有更高的亲和力，即PGB对P-gp的外排抑制作用更强，上述结果表明，当脑内同时存在PGB及PGB降解的GB时，PGB由于亲和力强易被外排出脑，从而有效减弱或阻断P-gp对GB的外排，最终使GB的脑内浓度升高，在一定程度上增强了GB的脑靶向性。

综上所述，PGB的脑靶向作用主要得益于较高的脂溶性和对P-gp的强抑制作用。以上研究结果提示：增大药物的脂溶性(logP)及药物与P-gp 亲和力可在一定程度上实现脑靶向给药，这对于脑靶向前药设计提供一种新的设计策略，即可以借助计算化学的logP 计算和分子对接的P-gp亲和力预测来设计筛选脑靶向前药。

[1] Strømgaard K, Nakanishi K. Chemistry and biology of terpene trilactones from ginkgo biloba [J].AngewChemIntEd, 2004, 43:1640-58.

[2] 黄贱英，孙建宁，梅世昌，黄纪明．银杏内酯B对缺血/再灌脑损伤大鼠的保护作用[J]．中国药理学通报，2008, 24(2):269-72.

[2] Huang J Y, Sun J N, Mei S C, Huang J M. Protective effects of ginkgolide B on cerebral ischemia reperfusion injury in rats [J].ChinPharmacolBull, 2008, 24 (2): 269-72.

[3] Lv P, Fang W R, Geng X H, et al. Therapeutic neuroprotective effects of ginkgolide B on cortex and basal ganglia in a rat model of transient focal ischemia [J].EurJPharmSci, 2011, 44 (3): 235-40.

[4] 王 磊，李 宁，韩德恩，等.环孢素A对银杏内酯B大鼠体内药动学的影响[J].药学学报，2009, 44 (6): 632-9.

[4] Wang L, Li N, Han D E, et al. Effec of cyclosporine A on the pharmacokinetics of ginkgolide B in rats [J].ActaPharmSin, 2009, 44 (6): 632-9.

[5] Suehiro M, Simpson N R, Underwood M D, et al.Invivobiodistribution of ginkgolide B, a constituent of Ginkgo biloba, visualized by MicroPET [J].PlantaMed, 2005, 71(7): 622-7.

[6] 王玉璘，王少侠，郭 红，胡利民.血脑屏障中P-糖蛋白的调节机制 [J].中国药理学通报，2011，27(9)：1196-200.

[6] Wang Y L, Wang S X, Guo H, Hu L M. Regulatory mechanisms of P-glycoprotein at the blood-brain barrier [J].ChinPharmacolBull, 2011, 27(9): 1196-200.

[7] 袁 媛. 银杏内酯B孪药脑靶向性和药效机制研究 [D].合肥工业大学, 2012.

[7] Yuan Y. Mechanisms research of brain targeting and pharmacodynamic of ginkgolide B twin drug [D]. Hefei University and Technology, 2012.

[8] 吴泽宇. 银杏内酯B前药设计、合成及脑靶向性研究 [D].合肥工业大学, 2012.

[8] Wu Z Y. Design, synthesis and brain targeting research of prodrug of ginkgolide B [D]. Hefei University and Technology, 2012.

[9] 潘 见,袁 媛,惠爱玲，等．银杏内酯B前体药物的抗血小板聚集活性研究[J]．中国药理学通报,2012,28 (10):1435-8．

[9] Pan J, Yuan Y, Hui A L, et al. Antiplatelet aggregative activity of prodrug of Ginkgolide B [J].ChinPharmacolBull, 2012, 28 (10):1435-8.

[10] Yuan Y, Pan J,Wu Z Y, et al. Validated LC-MS-MS method for the determination of prodrug of ginkgolide B in rat plasma and brain: application to pharmacokinetic study [J].JChromatogrSci, 2013, 51(3): 266-72.

[11] 张志荣. 靶向药物的药动学/药效学模型.[M]//张志荣等，编著. 靶向治疗分子基础与靶向药物设计. 北京: 科学出版社, 2005, 449-51.

[11] Zhang Z R.Drugtargetingpharmacokinetic/pharmacodynamicmodel. [M]//Zhang Z R, et al. Ed. Molecular basis of targeted therapy and drug targeting design. Beijing: Science Press, 2005, 449-51.

[12] 潘 见，吴泽宇，惠爱玲，陶 敏．银杏内酯B及其前药脂水分配系数的测定[J]．时珍国医国药， 2011，22(10): 2397-400.

[12] Pan J, Wu Z Y, Hui A L, Tao M. Determination of partition coefficients of ginkgolide B and its prodrug [J].LishizhenMedMatMedRes, 2011, 22(10): 2397-400.

[13] Hui A L, Chen Y, Zhu S J, et al. Design and synthesis of tacrine-phenothiazine hybrids as multitarget drugs for Alzheimer′s disease [J].MedChemRes, 2014, 23 (7): 3546-57.

[14] Aller S G, Yu J, Ward A, et al. Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding [J].Science, 2009, 373:1718-22.

[15] Wang J S, Zhu H J, Gibson B B, et al. Sertraline and its metabolite desmethylsertraline, but not Bupropion or its three major metabolites, have high affinity for P-glycoprotein [J].BiolPharmBull, 2008, 31 (2): 231-4.

[16] 臧彩红，张 艳，江金花，等. 盐酸千金藤碱逆转肝癌多药耐药性与P-gp ATP 酶活性的关系研究[J]. 中国药理学通报，2011，27(7):1002-6.

[16] Zang C H, Zhang Y, Jiang J H, et al. Effect of cepharanthine hydrochloride on overcoming multidrug resistance and P-gp ATPase activity in mice model of hepatocellular carcinoma [J].ChinPharmacolBull, 2011, 27(7): 1002-6.

On Brain targeting research of ginkgolide B prodrug

ZHU Shi-jing1, YUAN Yuan1,2, YIN Hua-yang1, HUI Ai-ling1, ZHOU An3, PAN Jian1

(1.InstituteofNaturalMedicine,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009，China; 2.ShenyangNormalUniversityCollegeofGrainScienceandTechnology,Shenyang110034,China; 3.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentofChineseMedicine,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the brain targeting of ginkgolide B prodrug (PGB) and its mechanism. Methods The liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was applied to investigate the pharmacokinetics of PGB in rat brain tissue after intravenous injection of PGB. Also the brain targeting was evaluated on the basis of the pharmacokinetic parameter of PGB. The incomplete cerebral ischemia model was induced in mouse, the effect of PGB on cerebral capillary permeability was observed by Evans blue method. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the partition coefficients (logP) of PGB in octanol-water system. PGB and P-glycoprotein (P-gp) was docked by using Molegro Virtual Docker (MVD) software to predict its binding abilities with P-gp. The interaction of PGB with ATPase activity of human P-gp membrane was estimated by measuring inorganic phosphate liberation. Results The brain targeting of PGB was evaluated by treatment effective (TA) and drug targeting index (DTI), the calculated value were 6.87 and 4.14 respectively. Preventive medication of PGB could significantly decrease cerebral capillary permeability (P<0.05). The lipo-hydropartition coefficient of PGB was higher than that of GB, their logP data were 1.03 and 0.61 respectively. PGB displayed the stronger binding affinity with P-gp than GB according to the molecular docking calculations, their MolDock Score toward P-gp were -143.36 and -116.40KJ·mol-1respectively. ATP-hydrolisis showed that PGB increased ATPase activity with aKmof approximately 237.75 μmol·L-1, however GB with aKmof approximately 841.24 μmol·L-1. PGB might interact with P-gp with a higher affinity and exhibit more effect than GB. Conclusion PGB is characterized by its brain targeting. Higher liposolubility of PGB results in good blood-brain permeability, which is advantageous to its brain targeting. Besides, PGB can effectively inhibit the efflux effect of P-gp to GB because of its increased P-gp ATPase activity.

ginkgolide B; prodrug; brain targeting; cerebral ischemia; lipo-hydropartition coefficient; P-glycoprotein; ATPase activity

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.002.html

2014-11-22,

2015-01-11

国家自然科学基金资助项目(No 21302037)；安徽省科技计划项目(No 11010401025)

朱世璟(1989-)，女，硕士生，研究方向：天然药物开发，Tel：0551-62901862，E-mail：970964309@qq.com； 惠爱玲(1980-)，女，博士，副研究员，研究方向：天然药物开发，Tel：0551-62901862，E-mail：haling@mail.ustc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.021

A

1001-1978(2015)04-0542-08

R-332；R284.1；R322.81；R743.31；R977.3；R977.6