高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的RP-HPLC检测方法的建立*

汪 洋， 魏 莲， 魏琳娜， 李 筱， 许利娜， 魏登邦

(青海大学高原医学研究中心， 西宁 810016)



高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的RP-HPLC检测方法的建立*

汪 洋， 魏 莲， 魏琳娜， 李 筱， 许利娜， 魏登邦△

(青海大学高原医学研究中心， 西宁 810016)

目的：探索N-isopropyl oxamate和血清蛋白结合水平，建立高原鼠兔血液中精子型乳酸脱氢酶(LDH-C4)特异性抑制剂N-isopropyl oxamate的高效液相色谱(HPLC)检测方法。方法：取体重150～200 g高原鼠兔20只，随机分为对照组和抑制剂组(n=10)。通过外源性加入不同浓度的N-isopropyl oxamate，检测其与血清蛋白的结合水平。采用将血清先用胰蛋白酶酶解，再加入三氯乙酸的前处理法进行HPLC检测。结果：当空白高原鼠兔血清加入抑制剂标准品达到血清中浓度为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L时，抑制剂与血清蛋白的结合率分别为100%、100%、100%、86.84%、54.11%、40.10%、20.18%。在本文建立的方法下，回收率、精密度、稳定性均良好。N-isopropyl oxamate在0.0125～0.25 mmol/L内浓度与峰面积线性关系好。空白血清加入标准品达到终浓度为0.15 mmol/L、0.3 mmol/L和 1 mmol/L时，平均回收率分别为98.05%、98.98%、98.12%；精密度相对标准偏差(RSD)分别为1.17%、0.92%、0.83 %；稳定性RSD分别为1.38%、1.40%、0.88%。方法的重复性RSD为1.76%，最低定量限为0.0125 mmol/L。结论：N-isopropyl oxamate与高原鼠兔血清具有很强的亲和力，直接用三氯乙酸沉淀蛋白的前处理方法无法准确检测其浓度，而先用胰蛋白酶消化血清，再用三氯乙酸沉淀蛋白的方法可实现血液中HPLC的精确检测。

高原鼠兔；精子型乳酸脱氢酶；N-isopropyl oxamate；高效液相色谱

精子型乳酸脱氢酶是乳酸脱氢酶的一种同工酶，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)同工酶亚基由ldh-a，ldh-b和ldh-c三个等位基因控制合成[1,2]。精子型乳酸脱氢酶是一种乳酸脱氢酶C(LDHC)亚基组成的同源四聚体(LDH-C4)[1,2]。LDH-C4对丙酮酸的亲和力是对乳酸亲和力的60多倍，且酶促反应不易受高浓度乳酸抑制，有利于无氧糖酵解的进行[3-5]。

先前的研究认为，LDHC只在鸟类和哺乳类的精子细胞中表达，而在体细胞中不表达[6]。本室的研究发现，LDHC不仅在高原鼠兔精子中表达，而且在其心、肝、肺、肾、脑和骨骼肌细胞中表达，其中骨骼肌中的表达水平较高[7]。高原鼠兔是青藏高原特有的一种高原动物，分布在海拔3 000～5 000 m 的高寒草原，其生存环境的显著特征是低氧，高原鼠兔对低氧环境有很强的适应性[8-12]。依据LDHC的酶促动力学特征，推测LDH-C4在高原鼠兔体细胞中的表达与高原鼠兔适应低氧环境有关。

N-isopropyl oxamate是对LDH-C4具有较高特异性的抑制剂[5,13,14]，当其浓度低于0.1 mmol/L时，对LDH-A4和LDH-B4的酶活力没有明显的抑制效果，但对LDH-C4的酶活力抑制效果达到70%；当其浓度达到10 mmol/L，它不仅抑制LDH-C4的酶活力，而且对LDH-A4和LDH-B4也表现出抑制作用[5]。为了研究LDH-C4在高原鼠兔体细胞中的功能及作用机理，我们用1 mmol/L浓度的N-isopropyloxamate通过腹腔注射和肌肉注射高原鼠兔，应用高效液相色谱法测定血清无蛋白滤液中的抑制剂浓度。结果发现，无论是腹腔注射还是肌肉注射，在抑制剂浓度为1 mmol/L，注射剂量为3 ml、2 ml、1 ml时，按传统的有机溶剂法前处理得到的血清无蛋白滤液中均检测不出抑制剂。

我们推测，原因可能是由于血清中LDH-C4与N-isopropyl oxamate亲和力高，当沉淀血清蛋白时，抑制剂随蛋白而沉淀。因此，本文先采用胰蛋白酶酶解血清蛋白，再进行有机溶剂沉淀法制备无蛋白滤液，应用高效液相色谱建立了高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate测定方法，以便控制抑制剂的剂量,以此建立一种简便有效的检测血液中与血清蛋白高亲合力化合物的新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260 HPLC 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配备G1354A 四元泵，G1313A自动脱气机，G1316A 柱温箱，G1315 二极管阵列检测器(DAD)和G1329 自动进样器；离心机(Eppendorf 5430R，美国Eppendorf公司)；高效液相色谱分析用甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司)；实验用水为超纯水。其它试剂：胰蛋白酶(1∶250，北京索莱宝生物科技有限公司)、三氯乙酸(天津凯通化学试剂有限公司)、0.9%生理盐水(山东华鲁制药有限公司)。N-isopropyl oxamate按照文献方法[13]合成。

1.2 实验动物分组、给药及样品采集

高原鼠兔捕捉于青海省海南州贵德县拉脊山(北纬36°72′，东经101°28′，海拔3 900 m)。样本量20只，体重150～200 g，随机分为2组(n=10)。第1组为空白对照组，注射1 ml 0.9%生理盐水于高原鼠兔股二头肌，双侧各注射500 μl；第2组为抑制剂组，注射1 ml 1 mmol/L抑制剂N-isopropyl oxamate于高原鼠兔股二头肌，双侧各注射500 μl。所有动物在实验前静息30 min，动物用5%戊巴比妥钠麻醉，采集血液并4℃保存。血液于4℃，5 000 r/min离心10 min，取血清。实验过程中动物处理方法均按照国家《实验动物管理条例(GB14923-2010)》执行。

1.3 N-isopropyl oxamate与高原鼠兔血清蛋白的结合率测定

1.3.1 计算血清蛋白结合率的标准曲线 精确称取N-isopropyl oxamate标准品1.31 g，溶于0.9% 生理盐水并定容至10 ml，即为1 mol/L，再分别用流动相稀释得到浓度为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L和100 mmol/L的标准品溶液。各浓度进样量均为50 μl，每种浓度做5份样品，以平均峰面积对标准品浓度进行回归计算，建立标准曲线。色谱条件：色谱柱 C18(Platisil ODS 5 μm，250×4.6 mm，Cat: 99503，USA)。流动相：水(A)-甲醇(B)梯度洗脱(0～40 min，B：10%～55%)。流速 1 ml/min，柱温25℃，检测波长230 nm。

1.3.2 高原鼠兔血清对N-isopropyl oxamate结合率的测定 各取250 μl空白组高原鼠兔血清按比例加入N-isopropyl oxamate标准品，使抑制剂在血清中的浓度分别达到0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L，再分别加入等体积10%三氯乙酸溶液，震荡使其充分混匀，10 000 r/min离心10 min，取上清进样，各浓度进样量均为100 μl。

通过色谱峰面积和标准曲线，利用外标法计算血清样品经三氯乙酸溶液沉淀蛋白后上清中的标准品浓度。结合率=(三氯乙酸处理前血清中标准品浓度-三氯乙酸处理后上清中剩余标准品浓度)/三氯乙酸处理前血清中标准品浓度×100%。

1.4 高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate高效液相色谱检测方法的建立

1.4.1 样品测定的标准曲线 称取N-isopropyl oxamate标准品65.5 mg，溶于0.9% 生理盐水并定容至50 ml，即为10 mmol/L，再分别用流动相稀释至0.0125 mmol/L、0.025 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L。各浓度进样量均为50 μl。每种浓度做5份样品，以平均峰面积对标准品浓度进行回归计算，建立标准曲线。按信号/噪音=10计算最低定量限。

1.4.2 样品前处理 取抑制剂组和空白对照组高原鼠兔血清各250 μl，95℃水浴15 min 热变性，加入250 μl 10%胰蛋白酶(1∶250)，充分搅拌混匀，42℃水浴孵育12 h，再加入等体积(500 μl)10%三氯乙酸溶液，震荡使其充分混匀，10 000 r/min离心10 min，取上清进样，进样量均为100 μl。色谱条件同1.3.1。

1.4.3 回收率、精密度、稳定性和重复性实验 取空白对照组高原鼠兔血清加入抑制剂标准品，使抑制剂在血清中的浓度分别达到0.15 mmol/L、0.3 mmol/L和1 mmol/L，各取5份按1.4.2方法处理并进样分析，测定峰面积，测定值与相同浓度标准品溶液测定值相比计算平均回收率(n=5)及精密度相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)(n=5)。稳定性实验取上述配制的血清样品各5份，分别室温放置0 h、2 h、4 h、6 h和24 h，按1.4.2方法处理并进样分析，测定峰面积，计算3个浓度血清样品的RSD。重复性实验取同一抑制剂组高原鼠兔血清按1.4.2方法分别处理5次并进样分析，测定峰面积，计算RSD。

2 结果

2.1 N-isopropyl oxamate与高原鼠兔血清蛋白结合率的标准曲线及计算结果

按1.3.2方法处理后，当空白高原鼠兔血清中抑制剂浓度为10 mmol/L、16.7 mmol/L、33.3 mmol/L、100 mmol/L时，N-isopropyl oxamate与高原鼠兔血清蛋白结合率分别为86.84%、54.11%、40.10%、20.18%；当血清中抑制剂浓度为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L时，上清中检测不到抑制剂，N-isopropyl oxamate与血清蛋白结合率为100%，该浓度下抑制剂已全部与血清蛋白结合，在无蛋白滤液制备过程中随蛋白而沉淀(图1)。

Fig. 1 Standard curveand calculating result of intergrating rate between N-isopropyl oxamate and plateau pika serum A: Standard curve for calculating the intergrating rate; B: Calculating result of intergrating rate

2.2 高效液相色谱法检测N-isopropyl oxamate的标准曲线

N-isopropyl oxamate在0.0125 mmol/L～0.25 mmol/L范围内浓度与峰面积有良好的线性关系，回归方程y=1736x+1.346，r=0.999(图2)。其峰型良好，无杂峰干扰，基线平稳(图3A)。

Fig. 2 HPLC standard curve of N-isopropyloxamate HPLC: High performance liqid chromato-graphy

2.3 高效液相色谱法检测高原鼠兔血清中N-isopropyl oxamate的方法学考察

N-isopropyl oxamate标准品出峰时间33 min(图3A)。空白对照组高原鼠兔血清按1.4.2方法处理后，在30 min 左右各时间点均未出峰(图3B)。空白对照组血清分别加入N-isopropyl oxamate标准品浓度达到0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L，按1.4.2方法处理后，31.3 min出峰(图3C)，低、中、高三个浓度的回收率均达到98%以上，上清中抑制剂浓度与空白血清中标准品加入量一致，31.3 min即为空白血清加入标准品后的出峰时间。抑制剂组血清按1.4.2方法处理后，出峰时间也是31.3 min(图3D)。因此可根据该处峰面积计算上清中N-isopropyl oxamate的浓度，1.4.2方法处理后的高原鼠兔血清样品能实现HPLC的准确检测。

在1.4.2色谱条件下，N-isopropyloxamate峰形良好，无杂峰干扰，基线平稳，最低定量限为0.0125 mmol/L。0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L三个浓度的平均回收率分别为98.05%、98.98%、98.12%；精密度RSD分别为1.17%、0.92%、0.83%；稳定性RSD分别为1.38%、1.40%、0.88%。该方法的重复性RSD为1.76 %。本方法适用高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate的定量分析。

Fig. 3 HPLC chomatogram A: HPLC chomatogram of N-isopropyloxamate; B: HPLC chomatogram of supernatantof blank pika plasmawith the treatmentof 1.4.2; C: HPLC chomatogram of supernatantof blank pika plasma added 0.15 mmol/LN-isopropyloxamatefollowed with the treatment of 1.4.2; D: HPLC chomatograms of supernatantof the serum in the inhibition group pikaswith the treatment of 1.4.2; HPLC: High performance liquid chromatography

2.4 高原鼠兔血液中N-isopropyl oxamate含量的计算结果

当注射1 ml 1 mmol/L N-isopropyl oxamate于高原鼠兔股二头肌，双侧各注射500 μl，静息30 min后，应用HPLC检测其血液中抑制剂浓度为(0.077±0.014)mmol/L。该浓度N-isopropyl oxamate对LDH-C4抑制率在70%左右，同时基本不抑制LDH-A4和LDH-B4(研究结果另行发布)。此浓度范围可研究LDH-C4在高原鼠兔低氧适应中发挥的作用。

3 讨论

N-isopropyl oxamate作为LDH-C4特异性抑制剂，其高亲和力和特异性归结于其特殊的氨基酸组成[15]。小鼠LDH-C4中的甘氨酸、苏氨酸、亮氨酸含量要明显高于其它同工酶，如亮氨酸残基比LDH-A4，LDH-B4高出40多个，亮氨酸的支链碳原子形成了疏水性的非极性基团[5]。我们比对高原鼠兔的LDH同工酶的氨基酸组成发现，LDH-C4的异亮氨酸数量比LDH-A4、LDH-B4均高出20多个。这些亮氨酸或异亮氨酸的的疏水性结构组成了LDH-C4酶活性中心区域，因此LDH-C4更容易与带侧链的非极性基团结合[5]。N-isopropyl oxamate的分子组成与LDH-C4的底物相近且具有非极性的支链结构，能与血清中LDH-C4紧密结合，利用常规的前处理方法无法将其分开。胰蛋白酶是一种高效的肽链内切酶，已广泛用于血液的酶解，能专一作用于由碱性氨基酸精氨酸和亮氨酸羧基所组成的肽键，有效打断肽链，解离释放N-isopropyl oxamate。

本文采用高原鼠兔血清中先加入胰蛋白酶42℃孵育12 h，使抑制剂与血清蛋白完全解离后，再加入三氯乙酸沉淀蛋白的前处理方法来检测血液中N-isopropyl oxamate的浓度。此方法灵敏、准确、重现性好，0.15 mmol/L、0.3 mmol/L、1 mmol/L三个浓度的平均回收率分别为98.05%、98.98%、98.12%；精密度RSD分别为1.17%、0.92%、0.83 %；稳定性RSD分别为1.38%、1.40%、0.88%。方法的重复性RSD为1.76%，最低定量限为0.0125 mmol/L。检测结果显示，当注射1 ml 1 mmol/L抑制剂于高原鼠兔股二头肌并静息30 min后，血液中的抑制剂浓度为0.077 mmol/L。综上可见，本文建立了一种HPLC的简便有效的检测方法。

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Establishment of RP-HPLC detection method of N-isopropyl oxamate in the serum of plateau pikas

WANG Yang, WEI Lian, WEI Lin-na, LI Xiao, XU LI-na, WEI Deng-bang△

(Research Center for High Altitude Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: To explore the intergrating of N-isopropyl oxamate and serum protein and establish a high performance liquid chromatography(HPLC)detection method of N-isopropyl oxamate (specific inhibitor of testis-specific lactate dehydrogenase (LDH-C4)) in the blood of plateau pikas. Methods: Twenty highland pika 150～200 g,were randomly divided into two groups(n=10): control group and inhibitor group.Different concentrations of N-isopropyl oxamate were added to examine the intergrating of N-isopropyl oxamate and serum protein. In order to determine its concentration in the pika blood accurately, we used the method of adding trypsin to incubate the serum first, followed by trichloroacetic acid treatment and detecting by HPLC. Results: When the concentrations of N-isopropyl oxamate in the pika serum were added to 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 1 mmol/L, 10 mmol/L, 16.7 mmol/L, 33.3 mmol/L and 100 mmol/L, the intergrating rates between N-isopropyl oxamate and plateau pika serum were 100%, 100%, 100%, 86.84%, 54.11%, 40.10% and 20.18%, respectively. The method established in this paper was good on recovery rates, precision and stability. A good linearity was obtained in the range of 0.0125-0.25 mmol/L. When the concentrations of N-isopropyl oxamate in the serum were added to 0.15 mmol/L、0.3 mmol/L and 1 mmol/L, the recovery rates were 98.05%, 98.98% and 98.12%, respectively; the precision relative standard deviation( RSD) of concentrations were 1.17%, 0.92% and 0.83 %, respectively; the stability relative standard deviation (RSD) of concentrations were 1.38%, 1.40% and 0.88%, respectively. The repeatability RSD of the method was 1.76%. Quantitative limit was 0.0125 mmol/L. Conclusion: N-isopropyl oxamate has a strong affinity with plateau pika serum protein that can't be accurately determined with common HPLC method. It can be accurately determined in the blood by adding trypsinto digest the serum protein first, followed by adding trichloroacetic acid to precipitate the protein.

plateau pika; LDH-C4; N-isopropyl oxamate; RP-HPLC

国家自然科学基金项目(31260512)；青海省自然科学基金项目(2012-Z-905，2014-ZJ-714)

2015-01-12 【修回日期】2015-06-05

Q95-3

A

1000-6834(2015)05-469-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.022

△【通讯作者】Tel： +86 971 5310695； E-mail: weidengbang@163.com