脊髓GSK-3β信号通路在大鼠慢性吗啡耐受形成中的作用*

郑国龙， 苏 珍， 安礼俊， 刘海林

(南京医科大学附属淮安一院麻醉科， 江苏 淮安 223300)



脊髓GSK-3β信号通路在大鼠慢性吗啡耐受形成中的作用*

郑国龙， 苏 珍， 安礼俊， 刘海林△

(南京医科大学附属淮安一院麻醉科， 江苏 淮安 223300)

目的：评价脊髓糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)信号通路在大鼠慢性吗啡耐受形成中的作用。方法：健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，经枕骨大孔行鞘内置管。取鞘内置管成功的40只大鼠，采用随机数字表法，将大鼠随机分为5组(n=8)：生理盐水组(C组)、慢性吗啡耐受组(M组)、吗啡+GSK-3β抑制剂(SB216763)组(MS组)、GSK-3β抑制剂组(S组)和二甲基亚砜组(D组)。皮下注射吗啡10 mg/kg，每天2次，连续5 d，建立吗啡耐受模型。在第6天皮下注射吗啡前30 min MS组、S组和DMSO组分别鞘内注射SB216763(溶于10 μl DMSO中) 14 pmol、SB216763 (溶于10 μl DMSO中)14 pmol和DMSO 10 μl。于皮下注射吗啡前1 d(基础值)、皮下注射吗啡后30 min第1、2、3、4和5天，第6天鞘内注射后1 h，测定大鼠甩尾潜伏期，以计算最大抗伤害效应百分比(MPAE)。鞘内注射4 h后取8只大鼠，处死后取脊髓组织，采用Western blot法测定p-GSK-3β的表达水平。结果：与第1天比较，M组和MS组第4、5天MPAE明显降低(P<0.05)；与C组比较，M组和MS组MPAE升高，M组脊髓GSK-3β表达没有变化，MS组脊髓p-GSK-3β表达上调(P<0.05)，DMSO组和S组上述指标差异无统计学意义；与M组比较，MS组MPAE升高，脊髓p-GSK-3β表达上调(P<0.05)。结论：脊髓GSK-3β信号通路可能参与了大鼠吗啡慢性耐受的形成。

吗啡；GSK-3β；脊髓；耐受；大鼠

morphine; glycogen synthase kinase; spinal cord; tolerance; rat

阿片类药物是临床上治疗急、慢性疼痛的重要药物，但

长期应用可产生慢性阿片耐受而影响治疗效果，因此研究慢性吗啡耐受的形成机制非常重要。以往的研究结果显示，长期吗啡应用可导致脊髓神经元产生可塑性改变，吗啡耐受引起的脊髓神经元可塑性与参与学习记忆形成的海马神经元可塑性有着诸多相同的细胞和分子机制[1]。脊髓糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种多功能酶，参与多种生物学过程，包括肿瘤发生、神经退行性疾病和细胞死亡[2]。研究表明，GSK-3β活性与学习记忆功能密切相关，而其抑制剂有神经保护的作用[3]。GSK-3β信号通路是否参与了慢性吗啡耐受的形成尚不清楚。本研究拟评价脊髓GSK-3β信号通路在大鼠慢性吗啡耐受形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 枕骨大孔鞘内置管模型建立

健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，由南京医科大学实验动物中心提供。参照文献[4]介绍的方法行鞘内置管。腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉下，从枕骨大孔开口处向下置入PE-10导管至腰膨大处(插入深度7.0～7.5 cm)。于置管后3 d，取无运动障碍的大鼠，鞘内注射2%利多卡因10 μl，注射后30 s内出现双下肢麻痹为鞘内置管成功。大鼠单笼饲养5 d后用于实验。

1.2 实验分组

取鞘内置管成功的健康雄性大鼠40只，采用随机数字表法，将大鼠随机分为5组(n=8)：生理盐水组(C组)、慢性吗啡耐受组(M组)、吗啡+GSK-3β抑制剂SB216763组(MS组)、二甲基亚砜组(DMSO组)和SB216763组(S组)于每天8∶00和20∶00分别皮下注射吗啡10 mg/kg，连续5 d，建立吗啡耐受模型。药物容积均为10 μl，给药后均以生理盐水10 μl冲洗导管，C组同时间给予同体积的生理盐水。

1.3 最大抗伤害效应百分比测定

皮下注射吗啡前1 d(基础值)、皮下注射吗啡后30 min、第1、2、3、4和5天，第6天鞘内注射后1 h，测定大鼠甩尾潜伏期(tail flick latency, TFL)。将鼠尾末端约1/3部分浸入水浴(51.5℃～52.5℃)内，记录鼠尾从浸入至甩出水面的时间，连续测定4次，间隔1 min，取后3次数据的平均值。上限值为15 s，防止鼠尾烫伤。剔除TFL小于基础值或大于15 s的大鼠。计算最大抗伤害效应百分比(maximum analgesic efffect MPAE)，公式为MPAE=(鞘内注射后TFL-TFL基础值)÷(15-TFL基础值)×100%。

1.4 Western blot法测定p-GSK-3β蛋白的表达

于最后一次鞘内注射结束后取8只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，快速将其胸腰段脊髓取出并放入液氮中冷冻保存备用。根据以下步骤进行蛋白提取：脊髓先放入预冷的匀浆液A (mmol/L)羟乙基哌嗪乙硫磺酸液 10, Na3VO41, MgCl21.5, KCl 10, NaF 50, 乙二胺四乙酸 (EDTA)0.1,乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)0.1,苯磺基氟化物0.5,二硫苏糖醇 1和0.02%蛋白酶抑制剂鸡尾酒,pH 7.9中，低温匀浆，加入90 μl 10%NP-40后剧烈震荡30 s，4℃ 800 r/min离心15 min，取上清液，即为细胞浆成分。胞浆蛋白分装-70℃保存备用。按Bradford法测定样本蛋白浓度后加入1/3体积的4倍样本缓冲液(250 mmol/L Tris/HCl, pH 6.8, 0.01%考马斯亮蓝G，8%十二烷基硫酸钠、200 mmol/L蔗糖、300 mmol/L二硫苏糖醇)，95℃变性5 min。取40 μg蛋白样本在10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后电转至硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜在3%牛血清封闭3 h后与p-GSK-3β一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，TBST冲洗，加入碱性磷酸酶标记的兔二抗(1∶1 000)，室温振荡孵育1.5 h，TBST冲洗，采用NBT/BCIP检测反应条带，半定量分析。采用图像分析仪测定条带吸光度值，反映GSK-3β蛋白的表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组MPAE的变化

与C组比较，M组和MS组皮下注射期间MPAE升高(P<0.05)，S组和D组差异无统计学意义；M组和MS组鞘内注射期间MPAE逐渐降低(P<0.05)，与M组比较，MS组鞘内1 h后MPAE升高(P<0.05，表1)。

Tab.

C: Control group; M： Morphine group; MS: Morphine and SB216763 group; S: SB216763 group; D: Dimethyl sulfoxide group； MAPE: Maxium analgesic effect

*P<0.05vsgroups C；#P<0.05vs1 day；△P<0.05vsgroups M

2.2 各组p-GSK-3β蛋白的表达

最后1次鞘内注射后，M组脊髓p-GSK-3β表达没有变化，与M组比较，MS组脊髓p-GSK-3β表达上调(P<0.05，表2)。

3 讨论

本研究参照Na ramoto K介绍的方法[1]，采用连续5 d皮下注射吗啡10 mg/kg的方法建立慢性吗啡耐受模型，结果表明，皮下注射吗啡期间MPAE逐渐降低，提示慢性吗啡耐受模型制备成功。本研究参照文献选择GSK-3β抑制剂的SB216763的剂量[5]，结果表明，连续鞘内注射吗啡时对脊髓背角磷酸化GSK-3β表达没有影响，但是给予GSK-3β的抑制剂SB216763后可明显上调脊髓背角磷酸化GSK-3β的表达，抑制慢性吗啡耐受的形成，大鼠MPAE升高，提示脊髓GSK-3β信号通路可能参与了大鼠慢性吗啡耐受的形成。

Groupp-GSK-3βC1.00±0.00M1.02±0.18S0.99±0.12D1.01±0.14MS2.01±0.18*

C: Control group； M： Morphine group； MS: Morphine and SB216763 group； S: SB216763 group; D: Dimethyl sulfoxide group

*P<0.05vsgroup M

GSK-3β参与糖代谢过程，处于凋亡通路中的交叉点，GSK-3β磷酸化后活性降低，是体内信号传导通路的重要蛋白之一[6]。本研究发现，吗啡耐受形成p-GSK-3β表达没有变化，给予GSK-3β抑制剂SB216763，p-GSK-3β表达增多，同时大鼠对吗啡的耐受得到逆转。GSK-3β信号通路参与吗啡耐受的可能机制如下：(1)长期应用吗啡作用于脊髓μ-阿片受体，导致了Gi/o蛋白的活化，激活了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)，GSK-3β是Akt激酶下游的一个重要的靶点[7]。(2)长期应用吗啡，上调cAMP信号通路，导致了纹状体内的多巴胺和cAMP调节的磷蛋白(DARPP-32蛋白)的磷酸化，引起GSK-3β的去磷酸化从而激活GSK-3β信号通路[8]。(3)长期应用吗啡也激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体，引起脊髓谷氨酸释放，导致了细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路上调，活化了核糖体S6(Rsk/S6k)激酶，导致GSK-3β磷酸化[9]。

综上所述，脊髓GSK-3β信号通路可能参与了大鼠慢性吗啡耐受的形成和维持。

[1] Nakamoto K, Kawasaki S, Kobori T,etal. Involvement of matrix metalloproteinase-9 in the development of morphine tolerance[J].EurJPharmacol, 2012, 683(1-3): 86-92.

[2] Hoppe JB, Coradini K, Frozza RL,etal. Free and nanoencapsulated curcumin suppress β-amyloid-induced cognitive impairments in rats: involvement of BDNF and Akt/GSK-3β signaling pathway[J].NeurobiolLearnMem, 2013， 106: 134-144.

[3] Lavoie J, Hébert M, Beaulieu. JMGlycogen synthase kinase-3β haploinsufficiency lengthens the circadian locomotor activity period in mice[J].BehavBrainRes， 2013, 15， 253: 262-265.

[4] Yaksh TL, Rudy TA. Analgesia mediated by a direct spinal action of narcotics[J].Sci， 1976, 192(4246): 1357-1358

[5] Parkitna JR, Obara I, Wawrzczak-Bargiela A,etal. Effects of glycogen synthase kinase 3beta and cyclin-dependent kinase 5 inhibitors on morphine-induced analgesia and tolerance in rats[J].JPharmacolExpThe， 2006， 319(2): 832-839.

[6] Jeon GS, Kim JE, Ahn SW,etal. Effect of JGK-263 as a new glycogen synthase kinase-3β inhibitor on extrinsic apoptosis pathway in motor neuronal cells[J].BiochemBiophysResCommun， 2013, 439(2): 309-314.

[7] Gim SA, Sung JH, Shah FA,etal. Ferulic acid regulates the AKT/GSK-3β/CRMP-2 signaling pathway in a middle cerebral artery occlusion animal model[J].LabAnimRes， 2013, 29(2): 63-69.

[8] Castorina A, DAmico AG, Scuderi S，etal. Dopamine D3 receptor deletion increases tissue plasminogen activator (tPA) activity in prefrontal cortex and hippocampus[J].Neurosci， 2013, 250: 546-556.

[9] Stone TW, Ceruti S, Abbracchio MP. Adenosine receptors and neurological disease: neuroprotection and neurodegeneration[J].HandbExpPharmacol， 2009， (193): 535-587.

参考文献的写法

1. 期刊文献：[序号] 作者. 题名[J]. 刊名, 出版年, 卷(期): 起止页码.

例：[1] Wang H, Bloom O, Zhang M,etal. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science, 1999, 285(5425): 248-251.

2. 专著文献：[序号] 作者. 题名[文献类型标志](M图书、S标准、C会议论文集、D学位论文等). 版本项(第1版可省略). 出版地: 出版者, 出版年: 引文页码.

例: [1] 余敏. 出版集团研究[M]. 北京: 中国书籍出版社, 2001: 179-193.

[2] 辛希孟. 信息技术与信息服务国际研讨会论文集[C]. 北京: 中国社会科学出版社, 1994.

[3] 孙玉文. 汉语变调构词研究[D]. 北京: 中国大学出版社, 2002.

3. 专利文献：[序号] 专利申请者或所有者. 专利题名: 专利国别, 专利号[P]. 公告日期或公开日期.

例：[1] 西安电子科技大学. 光折变自适应光外差探测方法: 中国, 0128777.2[P]. 2002-03-06.

南京医科大学发展基金重点项目(2012NJMU152)；淮安市科技支撑计划(HAS2013034)

2014-12-16 【修回日期】2015-02-11

R322.8

A

1000-6834(2015)05-389-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.002

△【通讯作者】Tel： 13852346816； E-mail： liuhailin 1971@163.com