丁基苯酞预处理对大鼠脑组织缺血/再灌注后HSP70表达的影响*

周 毅， 牛丽静， 齐凤苗， 郭 力△

(1. 河北医科大学第二医院神经内科, 石家庄 050000； 2. 河北省疾病预防控制中心医学研究所, 石家庄 050021；3. 冀州市医院内二科, 河北 冀州 053200)



丁基苯酞预处理对大鼠脑组织缺血/再灌注后HSP70表达的影响*

周 毅1， 牛丽静2， 齐凤苗3， 郭 力1△

(1. 河北医科大学第二医院神经内科, 石家庄 050000； 2. 河北省疾病预防控制中心医学研究所, 石家庄 050021；3. 冀州市医院内二科, 河北 冀州 053200)

目的：探讨丁基苯酞预处理对缺血/再灌注大鼠海马迟发性神经元死亡以及热休克蛋白70表达的影响。方法：126只大鼠分为实验对照组(36只)、脑缺血组(36只)、丁基苯酞组(6只)、丁基苯酞+脑缺血组(36只)、槲皮素+丁基苯酞+脑缺血组(6只)、DMSO+丁基苯酞+脑缺血组(6只)。建立大鼠全脑缺血/再灌注模型后。实验对照组、脑缺血组、丁基苯酞+脑缺血组下另加设5个亚组，为手术后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d组。用硫堇以及免疫组织化学染色的方法观察丁基苯酞对缺血/再灌注大鼠海马神经元迟发性死亡以及HSP70表达的影响。结果：丁基苯酞预处理可以减轻大鼠全脑缺血/再灌注损伤引起的海马CA1区锥体神经元迟发性死亡，明显增加CA1区HSP70的阳性表达，且持续时间较长(6 h-5 d)；应用HSP70抑制剂可以阻断丁基苯酞预处理诱导的大鼠脑缺血耐受。结论：丁基苯酞可能参与脑缺血/再灌注损伤的神经元保护作用，这一作用可能是通过上调HSP70的表达完成的。

丁基苯酞；脑缺血预处理；HSP70；全脑缺血；大鼠

恩必普(butylphthalide)即消旋-3-正丁基苯酞(DL-3-n-butylphthalide, NBP)软胶囊是我国成功研制的具有自主知识产权的治疗急性缺血脑卒中的一类化学新药，是人工合成的消旋体，其左旋体存在于芹菜籽中。目前有关丁基苯酞脑保护的资料多集中在对缺血性脑血管病的治疗上，研究表明丁基苯酞可以增加缺血区脑血流量和改善缺血区微循环，保护线粒体功能，抑制炎症反应，抑制钙内流，缩小局灶性脑缺血后梗死面积，减轻神经功能损伤程度，改善全脑缺血后的脑功能代谢等[1-3]，涉及脑缺血病理过程多个环节，对缺血性脑血管病具有较佳的治疗保护作用。应用药物模拟或诱导一些物质如腺苷、热休克蛋白(heat shock protein, HSP)等的表达，也可使神经细胞对缺血性损伤产生对抗作用，以达到对随后的损伤性脑缺血的保护[4]。丁基苯酞预防性用药即丁基苯酞预处理能否提高神经细胞对脑缺血的耐受性尚未见文献报道。研究丁基苯酞预处理对于发生脑缺血神经细胞的保护作用，将进一步完善丁基苯酞在治疗缺血脑卒中中的生理机制研究，对于丁基苯酞应用于更广阔的缺血神经细胞，缺血心肌细胞的保护、治疗，提供更详尽的实验数据。

本实验应用大鼠四血管闭塞全脑缺血(total cerebral ischemia,TCI)模型，观察丁基苯肽预处理对全脑缺血/再灌注引起的海马CA1区神经元迟发性死亡的影响，运用免疫组化技术观察脑缺血/再灌注前给与丁基苯肽预处理对海马CA1区HSP70表达的影响，并进一步用硫堇染色方法观察HSP70合成抑制剂槲皮素(Quercetin)对丁基苯肽预处理诱导的脑缺血耐受的影响，探讨HSP70在丁基苯肽预处理抗脑缺血/再灌注损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

健康雄性Wistar大鼠(体重280～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供)126只，购入后在实验室常温饲养48 h，适应实验室环境后用于实验。

兔抗HSP70抗体(Neoumarks), 槲皮素(Johnson Matthey)，Thionin(Sigma)。

丁基苯酞原液(1g/ml，批号050406，石药集团恩必普药业有限公司)0.75 ml溶于DMSO 150 ml中，形成5 mg/ml恩必普溶液，使用时按恩必普30 mg/kg剂量灌胃。

1.2 硫堇染色实验分组

36只大鼠分为6组(n=6)：实验对照组(Sham)、丁基苯酞组、脑缺血组(the total cerebral ischemia,TCI)、丁基苯酞+脑缺血组(NBP+TCI)、槲皮素(Quercetin)+NBP+TCI和DMSO+NBP+TCI。(1)Sham组：行全脑缺血的sham手术；(2)NBP组：行丁基苯酞预处理；(3)TCI组：全脑缺血8 min；(4)NBP+TCI组：丁基苯酞预处理后1 d行全脑缺血8 min；(5)Quercetin +NBP+TCI组：丁基苯酞预处理前30 min给与Quercetin(50 mg/kg，腹腔注射)，其余同NBP+TCI组。(6)DMSO+NBP+TCI：丁基苯酞预处理前30 min给与3% DMSO (4 ml/kg体重，腹腔注射)，其余同NBP+TCI组。所有大鼠在sham手术或末次手术后7 d断头取脑，硫堇染色确定海马CA1区组织学分级(histological grade，HG)和神经元密度(neuronal density，ND)，以反映迟发性神经元死亡(delayed neuronal death，DND)情况。

1.3 HSP70免疫组织化学染色实验分组

90只椎动脉永久凝闭的大鼠随机分为3组。(1)Sham组：行全脑缺血的sham手术；下设五个亚组(n=6)：分别为脑缺血sham手术后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d组，各组于手术后相应时间点取材。(2)TCI组 全脑缺血8 min。下设五个亚组(n=6)：分别为脑缺血后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d组，各组于脑缺血后相应时间点取材。(3)NBP+TCI组：丁基苯酞预处理1 d后行全脑缺血8 min；下设五个亚组：分别为脑缺血后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d组，各组于脑缺血后相应时间点取材(n=6)所有动物于规定时间点断头取材，石蜡包埋，免疫组织化学染色观察大鼠海马CA1区HSP70的表达。

1.4 模型复制

采用Pulsinelli四血管闭塞法。首先在10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉下凝闭双侧椎动脉。麻醉后大鼠俯卧位固定，剪毛、纵行切开枕部及后颈部皮肤，切口长约1.5 cm；钝性分离脊柱旁肌肉，暴露第一颈椎横突；在体视显微镜下仔细寻找两侧的翼状孔，将预热的电灼针插入翼状孔中，烧灼在翼状孔中走行的椎动脉，使其永久性闭塞；庆大霉素盐水冲洗、缝合创口。手术完毕供以水、食，2 d后在乙醚麻醉下将大鼠仰卧位固定于鼠台上，切开颈前皮肤，分离双侧颈总动脉并穿线备用，实验时用无损伤小动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉进行全脑缺血8 min，再松开。夹闭颈总动脉期间，大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，表明大鼠产生了全脑缺血。实验对照组手术包括以上所有步骤，但不夹闭颈总动脉。手术及全脑缺血过程中，创口局部施与局麻药(1%普鲁卡因)防止疼痛，室温保持在20℃以上；用白炽灯照射动物以维持其肛温在37℃左右，直到恢复活动。全脑缺血8 min后缝合创口，局部施与庆大霉素预防感染。

1.5 取材与硫堇染色

所有动物于末次手术后7 d断头取材，大鼠断头处死，迅速取脑，用生理盐水清洗表面血液，冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，10%福尔马林固定4℃过夜，常规脱水透明，石蜡包埋，5 μm厚组织切片，硫堇(thionin)染色，梯度酒精脱水，二甲苯固定后中性树胶封片。光学显微镜下观察大鼠海马CA1区椎体DND。参照Kitagawa和Kato分级方法，根据DND的程度，对海马CA1区组织学改变进行评价。(1)组织学分级(histological grade，HG)，标准如下：0级，无神经元死亡；Ⅰ级，散在的神经元死亡；Ⅱ级，大片的神经元死亡；Ⅲ级，几乎全部的神经元死亡。(2)神经元密度(neuronal density，ND)，计数双侧海马CA1区1 mm区段内排列整齐，细胞膜完整、细胞核饱满、核仁清楚的锥体细胞数目，每侧海马CA1区各计数5个区段，取平均数为ND值。

1.6 HSP70免疫组织化学染色

大鼠断头处死，迅速取脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，用4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋。连续切片，片厚5 μm，展片，脱蜡，免疫组织化学染色显示HSP70在海马的表达。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 硫堇染色结果及脑组织病理学评价

硫堇染色结果显示，sham组大鼠海马CA1区损伤不明显，椎体细胞排列整齐致密，层次分明，尼氏小体丰富，胞核大而圆，染色较深，核仁深染，清晰；sham组和NBP预处理组大鼠海马CA1区无明显的DND(图1A、C，图1见彩图页Ⅲ)，HG为0～Ⅰ级，ND分别为(200.2±5.1)n/mm2、(201.3±5.4)n/mm2(表 1)。TCI组大鼠海马CA1区组织损伤明显(图 1 B)，大部分椎体细胞缺失，多数细胞胞核固缩，核仁不清晰，尼氏小体减少或消失，椎体细胞周围出现大量细胞碎片；与sham组和NBP预处理组比较，HG明显升高，ND显著降低(表 1)。这些变化提示，8 min TCI损伤引起海马CA1区出现了严重的DND。NBP预处理+TCI组中，海马CA1区未见明显细胞损伤(图1 D)，椎体细胞排列整齐致密，胞核饱满，核仁较清晰，只有个别椎体细胞胞核固缩，没有明显的细胞缺失，其HG和ND值与sham组相近；而与TCI组相比，其HG明显降低，ND值明显升高(表 1)，表明NBP预处理可诱导产生脑缺血耐受，减轻脑缺血/再灌注引起的海马CA1区锥体神经元DND。给予3% DMSO对丁基苯酞诱导的脑缺血耐受无明显影响(图1 E)，其HG和ND与NBP预处理+TCI组相近(表1)。然而，给予Quercetin则明显阻断了丁基苯酞的脑保护作用，在海马CA1区出现了明显的DND(图 1 F)，与NBP预处理+TCI组相比，其HG明显升高，ND值明显降低(图1)。

2.2 HSP免疫组织化学染色结果

HSP70阳性表达产物为棕黄色颗粒，多见于神经元胞质和突起，有时可见于胞核。sham组海马神经元中少见明显的HSP70蛋白表达(图2见彩图页Ⅲ)。8 min的单纯TCI组，CA1区于再灌注各时间点可见少量HSP70阳性表达(图 2)；在CA3、CA4区及齿状回区可见大量HSP70阳性表达。在NBP+TCI组，再灌注6 h海马CA1区可见少量的HSP70弱阳性表达(图 2)，阳性细胞总面积和平均光密度与TCI组比较无显著差异(图 3)；再灌注12 h CA1区出现部分HSP70的阳性表达，与sham和TCI的12 h组比较，阳性细胞数量(图2)、阳性细胞总面积和平均光密度已明显增加(NBP+TCI组平均光密度0.134±0.002；阳性细胞总面积(165310±256)μm2，P<0.01，图 3)；再灌注1 d后CA1区HSP70表达显著增强，数量明显增加，达到高峰，可见大量神经元的胞质及突起呈棕黄色HSP70阳性染色(图 2)，阳性细胞总面积和平均光密度较sham和TCI的1 d组显著升高(NBP+TCI组平均光密度0.217±0.006；阳性细胞总面积(185270±245)μm2，P<0.01，图3)；再灌注3 d后海马CA1区仍维持较高的HSP70表达水平(图 2)，阳性细胞总面积和平均光密度仍明显高于sham和TCI的3 d组(NBP+TCI组平均光密度0.117±0.003；阳性细胞总面积(137560±278)μm2，P<0.01)，但与1 d组相比较已开始回落(图 3)；再灌注5 d仍可见到CA1区少量HSP70阳性表达(图 2)，阳性细胞总面积仍明显高于sham和TCI的5 d组(NBP+TCI组阳性细胞总面积(100120±285)μm2，P<0.01，图3)。

Tab. 1 Effect of Quercetin, an inhibitor of HSP70, on histological grade (HG) and pyramidal neuronal density (ND) in the hippocampal CA1 region

GroupHistologicalgrade0～Ⅰ～Ⅱ～Ⅲ ND(n/mm2)Sham5100200.2±5.1NBP6000201.3±5.4TCI0024**44.3±8.3**NBP+TCI0600##157.0±6.9##DMSO+NBP+TCI0420159.5±7.9Quercetin+NBP+TCI0051△△122.8±8.2△△

NBP: Butylphthalide; TCI: Total cerebral ischemia; DMSO: Dimethyl sulfoxide

**P<0.01vssham and NBP groups;##P<0.01vsTCI group;△△P<0.01vsNBP+TCI group and DMSO+NBP+TCI group

3 讨论

脑缺血性疾病是危害人类健康的重要疾病，死亡率和致死率都较高。积极疏通血管和恢复血液供应是治疗的根本。但是神经细胞对缺血性损伤极为敏感，缺血一定时间后，神经细胞会大量死亡，即使恢复血液供应，神经细胞也很难再生，仍然会给患者留下严重的后遗症。因此充分调动机体内源性保护机制，提高神经细胞对缺血性损害的耐受对于预防脑缺血损伤具有重要意义。基础研究表明，丁基苯酞可以通过多种机制对抗缺血对神经元造成的损伤。如增加线粒体的生物合成[5]，抑制细胞凋亡[6-8]，减少氧化应激损伤[9,10]，抑制胶质细胞的活化[11,12]，保护神经元活性[13]，促进血管再生，调节中枢胆碱能系统等，来预防神经元的病理性改变。

Fig. 3 Quantitative analysis of immunostaining represented with optical density (A) and total area (B) of HSP 70 positive cells in CA1 regions of the hippocampus NBP： Butylphthalide; TCI: Total cerebral ischemia**P<0.01vssham group;##P<0.01vsTCI group

有文献报道，在全脑缺血/再灌注模型中海马CA3区与齿状回颗粒细胞中HSP70合成最多，CA1区合成HSP70较少，因此CA1区大部分神经元在缺血/再灌注后死亡，而海马CA3 区与齿状回对缺血的耐受程度较强，神经细胞得以存活，海马各区对脑缺血损伤的选择性易损程度可能与HSP70的选择性表达有关[14]。许多研究表明HSP70可能参与缺血预处理诱导的缺血耐受[15]，脑内过度表达HSP的转基因大鼠对创伤和缺血的耐受性增强。局灶缺血预处理可使梗死区HSP70的合成增加，并诱导脑缺血耐受[16]，HSP70表达量的增加可能对缺血耐受的形成是必要的。

本实验发现，丁基苯酞预处理可以改善全脑缺血8 min引起的大鼠海马CA1区神经元的迟发性死亡。NBP预处理+TCI组，大鼠海马CA1区无明显细胞缺失，与TCI组比较，组织学分级HG明显降低，神经元密度值ND明显升高。在HSP70组化染色时发现，sham组海马神经元中少见明显的HSP70蛋白表达，TCI组，CA1区于再灌注各时间点可见少量HSP70表达，NBP预处理+TCI组，HSP70的表达随再灌注时间的延长存在动态变化，与sham组相比较，大鼠海马HSP70的表达于丁基苯酞预处理后全脑缺血8 min后再灌注6 h开始升高，1 d达到高峰，3 d维持在较高水平，再灌注5 d仍可见到CA1区少量HSP70阳性表达。说明丁基苯酞预处理能够使大鼠海马CA1区HSP70合成明显增加。本实验中sham组大鼠各时间点海马CA1区HSP70无明显表达。TCI组HSP70阳性表达主要位于海马CA3区和齿状回，这里对缺血损伤有很强的耐受性，单纯损伤性脑缺血/再灌注各时间点在缺血敏感的CA1区均未见HSP70的明显表达，与文献报道HSP70的表达一致[17]。

我们进一步的研究发现，运用HSP70的特异性抑制剂槲皮素可以阻断丁基苯酞预处理诱导的大鼠脑缺血/再灌注耐受。槲皮素处理后，与DMSO组比较海马CA1区HG升高，ND值降低。既往Fujiki等[4]在大鼠脑缺血预处理研究中发现，口服HSP70诱导剂替普瑞酮能减轻脑缺血后大鼠海马锥体神经元的迟发性死亡。HSP70作为分子伴侣促进蛋白质正确折叠、移位、修复或降解，促进细胞的正常代谢和损伤的修复，以及抑制小胶质细胞的活化，减少金属蛋白酶基质的产生等，提高细胞对应激反应的耐受性，而具有神经保护作用[18]。HSP70在缺血预处理中可能还通过促进再缺血后c-fos，bcl-2的表达[19]，抑制caspase-3的表达[20]，对抗神经细胞的凋亡，从而诱导脑缺血的耐受。

HSP70作为一种内源性保护蛋白，丁基苯酞预处理可能通过诱导海马CA1区HSP70的表达而发挥其脑保护作用。HSP70参与丁基苯酞诱导的脑缺血耐受的产生，其表达上调是丁基苯酞诱导缺血耐受的可能分子机制之一。

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Effect of 3-n-butylphthalide pretreatment on expression of the HSP70 after brain ischemia/reperfusion

ZHOU Yi1， NIU Li-jing2， QI Feng-miao3， GUO Li1△

(1. The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000; 2. Hebei Province Center for Disease Prevention and Control,Shijiazhuang 050021; 3. Jizhou City Hospital, Jizhou 053200, China)

Objective: To explore the effect of 3-n-butylphthalide pretreatment on the delayed neuronal death(DND) and the expreesion of heat shock protein70(HSP70)in rat hippocampus after ischemia/ reperfusion. Methods: All rats were randomly divided into sham group(n=36), total cerebral ischemia(TCI) group(n=36), butylphthalide(NBP) group(n=6), NBP + TCI group(n=36), quercetin + NBP + TCI group(n=6), dimethyl sulfoxide(DMSO)+NBP + TCI group(n=6). The model of total cerebral ischemia/reperfusion was established by blocking vertebral arteries and carotid arteries. In sham group, TCI group and NBP group, the animals were further divided into instantly, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d, 5 d groups according to the time interval after sham operation or TCI. Histological changes of the hippocampus were evaluated using thionin staining under light microscope by determining the delayed neuronal death (DND) and the expression of HSP70 was assayed using immunohistochemistry. Results: NBP pretreatment could reduce delayed neuronal death in CA1 of hippocampus induced by TCI-reperfusion injury in rats， and up-regulated the expression of HSP70 in CA1 hippocampus of brain ischemic/reperfusion for 5 days. Quercetin blocked the acquirement of the brain ischemic tolerance induced by NBP preconditioning. Conclusion: 3-n-butylphthalide(NBP) prevents the neurons from ischemia/reperfusion injury through upregulating the expression of HSP70.

butylphthalide; brain ischemic preconditioning; HSP70; total cerebral ischemia; rat

2014-08-21

2014-10-31

R365

A

1000-6834(2015)02-136-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.011

△【通讯作者】Tel: 0311-66003912; E-mail: guoli6@163.com