山丹丹皂苷提取工艺初探

贺晓龙，邵 青，姚 尧，王延峰，2*，张 昊

(1.延安大学生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心；3.陕西省红枣重点实验室(延安大学)，陕西延安716000)

山丹丹皂苷提取工艺初探

贺晓龙1，2，3，邵 青1，姚 尧1，王延峰1，2*，张 昊1

(1.延安大学生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心；3.陕西省红枣重点实验室(延安大学)，陕西延安716000)

用正交试验方法对山丹丹总皂苷提取工艺中的温度、乙醇浓度、料液比和提取时间4个因素进行研究比较，使用AB-8大孔吸附树脂进行分离，冷冻干燥得到纯山丹丹皂苷。以三七总皂苷为标准，用紫外可见分光光度计在270 nm出对山丹丹总皂苷的含量进行测定，筛选出简单可靠，并且适合工厂化生产的山丹丹总皂苷的提取工艺。最佳的提取工艺条件是：提取温度为70℃，料液比为1∶10，回流提取时间为3 h，提取液浓度为80%。

山丹丹；皂苷；提取

山丹丹，学名也叫细叶百合，属于百合科百合属植物，其肉质鳞茎的鳞片。据医药典籍《本草纲目》记载，百合味甘、微苦、性平、具有补益心肺、固肾、补脑、清心、安神、镇静、清润肺燥、调理脾胃、养阴止血、消暑等功效[1，2]。研究证明，百合中主要含有酚酸甘油酯、甙类、生物碱及其多糖，它们都是有药用价值的活性成分，皂甙对人体的新陈代谢起着重要的生理作用，可以抑制血清中脂类氧化，抑制过氧化脂质的生成，降低血清中胆固醇的含量，抑制过氧化脂质对肝脏的损伤，防止动脉硬化和抗肿瘤的等作用[3-5]。

本文以陕北山丹丹种球为原料，采用4因素3水平进行正交试验，对其总皂苷的提取工艺进行优化，为山丹丹总皂苷的提取探索出一条较为合理的提取工艺，为山丹丹的综合开发利用提供了参考依据。

1 材料与试剂

1.1 供试材料

山丹丹种球，由延安大学生命科学学院提供。新鲜山丹丹种球清洗干净于常温下通风阴干至干燥后，用粉碎机粉碎，过100目筛，用密封瓶干燥保存备用。

1.2 仪器与试剂

干燥箱、粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发仪、低速离心机、超声波清洗器、UV-2600紫外可见分光光度计、真空干燥器等实验室常用仪器设备；乙醇、正丁醇、三七皂苷对照品(纯度为99.0%)，蒸馏水等实验药品。

1.3 试剂的配制

1.3.1 三七皂苷对照液

精确称取三七总皂苷对照品100 mg，溶解在10 mg去离子水中，摇匀[4]。

1.3.2 水饱和正丁醇

在150 mL的分液漏斗中分别加入21 mL水和100 mL正丁醇，振摇3 min后，静置分层去下层，上层则为水饱和正丁醇[5]。

1.3.3 乙醇溶液

分别配浓度为60%、70%、80%的乙醇溶液，备用。

2 试验方法

2.1 单因素提取试验

2.1.1 提取温度

查阅文献[6]针对温度对皂苷提取的影响，我们从而设置了较为精细的三个温度点：65℃、70℃、75℃进行试验。固液比为1∶10，提取时间为2.5 h的条件下，精确称取5 g进行试验，提取得到的皂苷含量分别记做A1，A2，A3。

2.1.2 料液比

根据提取液浸没山丹丹粉末的最小的提取液体积比为1∶6。因此本实验设置了三个料液比分别为：1∶6、1∶8、1∶10。而后精确称取5g山丹丹样品，提取温度为70℃，提取液浓度为70%乙醇溶液，提取2.5 h，得到的皂苷粗品分别记做B1，B2，B3。

2.1.3 提取时间

设置三个时间梯度2 h、2.5 h、3 h，从而精确称取5 g山丹丹样品，在70℃下加入1∶10的70%乙醇溶液，分别提取得到皂苷粗品记做C1，C2，C3。

2.1.4 提取液浓度

当乙醇浓度低于60%的，蛋白质很难以沉淀或离心的形式被除去。导致提取液混浊，不利于后续的分离工作，因此选择的提取液浓度为60%、70%、80%三个浓度点。实验是在精确称取50 g山丹丹样品，在70℃下，料液比为1∶10，提取时间为2.5 h，分别得到皂苷粗品记做D1，D2，D3。

2.2 山丹丹皂苷的提取及纯化

2.2.1 山丹丹皂苷的提取

精确称取5 g山丹丹粉末，精确至0.01，按正交试验表所列条件用不同浓度乙醇在水浴中加热回流提取数次，而后合并提取液，过滤并回收乙醇至干，残渣加水溶解至无醇味，用水饱和正丁醇萃取5次至正丁醇层无色，回收正丁醇后水浴浓缩蒸干，用少许去离子水溶解备用，用AB-8大孔吸附树脂柱吸出糖类等不被吸附的物质，用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，并浓缩至干，用去离子水溶解，冷冻干燥24 h后，分别收集山丹丹皂苷粗品，用去离子水分别定容至50 mL，待用。

2.3 山丹丹皂苷的分析方法

2.3.1 三七总皂苷的吸光值测定

精确称取100 mg三七总皂苷，用10 mL水溶解，吸取1 mL原液，稀释成5 mL，用UV-2600紫外分光光度计进行光谱扫描，测定其紫外吸光值为270 nm。

2.3.2 标准曲线的绘制

精确称取100 mg三七总皂苷，用10 mL水溶解，配成10 mg/mL的标准溶液，用移液枪分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞试管内，分别加去离子水稀释成5 mL，摇匀，静止5 min。以去离子水作空白对照，用UV-2600分光光度计于270 nm处测定其吸光度，平行测定3次。以样品浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(见图1)。线性方程为y=1.754x+0.074，r2=0.9992。

图1 皂甙标准曲线

2.3.3 山丹丹总皂苷含量测定

将冷冻干燥得到的皂苷粉末用去离子水溶解，定容至25 mL，从各组中分别吸取1 mL，加入4 mL去离子水，摇匀，静止5 min，置于UV-2600紫外分光光度计下测定其浓度，根据标准曲线法计算样品总皂苷的含量。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取温度的选择，提取温度对山丹丹总皂甙提取的影响，结果见表1。

表1 提取温度对山丹丹总皂甙提取的影响

由表1可以看出，在一定的温度范围内，皂苷提取量先增加后降低，在70℃的时候到达最高值。经本实验确定最佳提取温度为70℃。

3.1.2 料液比的选择，料液比对山丹丹总皂甙提取的影响，结果见表2。

表2 料液比对山丹丹总皂甙提取的影响

根据表2中的料液比的增加山丹丹总皂苷的提取量在逐渐增加，因此结合提取液用量和成本方面的综合因素，最适的料液比为1∶10。不过不提倡使用过多提取液。

3.1.3 提取时间的选择，提取时间对山丹丹总皂甙提取的影响，结果见表3。

表3 提取时间对山丹丹总皂甙提取的影响

根据表3的提取时间的增多，山丹丹总皂苷的提取量就相应得增多，而进一步增加提取时间会讲题山丹丹皂苷的提取效率，因此在提取时间为3 h的时候，山丹丹皂苷的提取率达到最优。

3.1.4 提取液浓度的选择，提取浓度对山丹丹总皂甙提取的影响，结果见表4。

表4 提取浓度对山丹丹总皂甙提取的影响

从上表可以得出，当提取液浓度为80%的时候，山丹丹总皂苷的提取量最多，因此，本实验确定最佳的提取浓度为80%。

3.2 正交试验设计及结果分析

根据单因素实验的结果，选择提取温度、料液比、提取时间和提取液浓度四个作为考察因素，每个因素各取3个水平进行4因素3水平的正交试验[7]。考察因素及具体水平见表5，试验结果见表6，方差分析结果见表7。

表5 正交试验设计表

通过比较各因素的极差值可以看出，影响总皂苷的因素顺序是提取液浓度>提取时间>料液比>提取温度，得出最佳提取条件为提取温度75℃，料液比1/8，提取时间2 h，提取液浓度80%。

通过表6可以看出各因素的极差值分别为RA=0.947、RB=0.833、RC=0.603、RD=1.08。通过比较各因素的极差值R的大小可以得出影响总皂甙的提取的因素顺序为提取液浓度>提取温度>料液比>提取时间，即最佳提取条件为A2B3C3D3。

表6 正交试验结果

从表7可以看出影响山丹丹总皂苷提取的因素中，提取温度具有极显著性差异，说明温度对总皂苷含量的影响最为显著，而料液比和提取时间有显著性差异，说明料液比和提取时间对总皂苷的提取有一定影响。结合实际生产即用浓度为70%，在60℃回流提取3次，每次3 h。经方差分析[8]可以的出A、B、C都具有特别显著性差异，表明提取温度、料液比、提取时间对总皂甙含量的影响显著。而提取液浓度对提取效果影响较小。

表7 正交试验方差分析表

3.3 效应曲线图结果分析

通过图2能更为直观的分析出，提取温度、料液比、提取时间这3个的因素是随着设置的增加提取率则相应得增加。提取液浓度则是先降低再增加。结合之前正交设计试验的结果，可以得出本次试验最佳的提取方案为A2B3C3D3，即提取温度为70℃，1∶10的料液比例，回流提取3 h，提取液浓度为80%。

图2 山丹丹总皂甙提取效应曲线图

4 结论

4.1 本试验通过单因素实验得知提取温度、料液比、提取时间和提取液浓度对山丹丹皂苷提取效果有一定的影响。根据正交试验研究，在一定的基础上明确了山丹丹皂苷提取过程中的各个条件的摸索以及优化，并且得出了在70℃，10倍于材料的80%的乙醇提取液，提取3 h的条件下，可以得到比较高的山丹丹皂苷提取量。

4.2 试验中的还存在如下问题：由于试验条件和时间的限制，只选取了三个比较窄的范围作为考察内容，而在提取液浓度方面应该设置更为广泛的浓度梯度，以便于更为准确的找出适宜的提取浓度，提高提取产量；本试验参考相关文献综合比较选择了提取次数为3次，而没有进行试验性的研究探索，后续工作会针对提取次数对皂苷提取率的影响做进一步的试验研究；在提取过程中发现部分提取液的浪费比较严重，这必然造成极大浪费。

[1]中国人民共和国卫生部药典委员会.中国药典，1995版[M].广州：广东科技出版社，1995：107.

[2]吴晓斌，任凤莲，邱昌桂，等.百合皂苷的提取﹑纯化及其鉴定[J].广州化学，2005，30(2)：36-40..

[3]杨林莎，孙艳红，方晓艳.中药百合的研究进展[J].河南中医药学刊，2002，17(1)：74-6.

[4]吴英华，郭宇，任凤莲.打孔媳妇数值春花百合皂甙的工艺研究[J].化工科技，2009，17(3)：24-25.

[5]梁朝辉.黄豆皂甙的提取和分离方法的初探[J].中国公共卫生，1999，15(11)：1043-1044.

[6]潘青友.百合渣中总皂苷的提取纯化与免疫活性研究[D].无锡：江南大学，2013.

[7]郑用熙.分析化学中的数理统计方法[M].北京：科学出版社，1986：180-219.

[8]王叔淳.食品分析数理统计与质量控制[M].北京：人民卫生出版社，1991：68-101.

[责任编辑 李晓霞]

2015-03-10

陕西省高水平大学建设专项资金资助项目(生物学2012SXTS06)，陕西科技厅农业攻关项目(2012k01-12)，陕西省教育厅科研计划项目(2012JK835)，延安市科技项目(2012ks-13)共同资助。

贺晓龙(1982—)，男，陕西临潼人，延安大学实验师。 *通讯作者

Q946.83

A

1004-602X(2015)02-0073-04