原花青素对镉引起的鸡胚睾丸氧化损伤的缓解作用

侯福银，宓君鹏，刘兴廷，李剑，米玉玲，张才乔

浙江大学动物科学学院，杭州 310058

原花青素对镉引起的鸡胚睾丸氧化损伤的缓解作用

侯福银，宓君鹏，刘兴廷，李剑，米玉玲*，张才乔#

浙江大学动物科学学院，杭州 310058

为探索原花青素对镉引起的鸡胚睾丸氧化损伤的缓解作用，本实验设置了对照组、镉、葡萄籽提取物原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)和镉+GSPE组，在胚胎期第6.5天(E6.5)注射0.05 mg·kg-1镉或2.5 mg·kg-1GSPE，统计孵化率和睾丸指数，并在E17.5检测睾丸形态、氧化指标、细胞凋亡和内质网应激相关基因的表达情况。结果表明：与对照组相比，镉处理组孵化率和睾丸指数均显著降低；睾丸组织结构出现了细胞核固缩、空泡化和染色质周缘化等变化，过氧化氢和丙二醛水平升高、超氧化物歧化酶活性显著降低、谷胱甘肽含量明显减少，凋亡细胞显著增多；睾丸中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平下降，同时促凋亡基因Caspase3和内质网应激相关基因(XBP-1和HO-1)mRNA表达水平显著上升。然而，GSPE联合处理，明显缓解了镉引起的睾丸损伤，使孵化率和睾丸指数回升，抗氧化水平和内质网应激得到改善，凋亡细胞显著减少，睾丸形态趋于正常。结果表明：GSPE可通过其抗氧化作用降低XBP-1相关的内质网应激基因的表达，从而缓解镉引起的鸡胚睾丸生殖毒性。

镉；鸡胚；睾丸；氧化损伤；原花青素

镉(Cadmium，Cd)是一种人体非必需的二价重金属离子，随着工农业的迅速发展，其广泛应用于电镀、核工业和蓄电池等生产中，极易造成生态环境的污染[1-3]。同时，Cd易通过饮水、吸烟、食物和空气进入人和动物体内，继而蓄积在肝脏、肾脏和睾丸等组织器官，造成不同程度损害[4-9]。近些年，有关职业接触引发的镉疾病、环境污染导致的镉超标和镉大米等事件，引起了人们的广泛重视。越来越多的研究表明，Cd能够引起睾丸发育异常，生精作用紊乱甚至不育[10]。并且，Cd可显著降低鸡胚抗氧化水平和孵化率[11]。有学者认为，内质网应激和线粒体信号通路共同作用，调节Cd引起的睾丸生殖细胞凋亡[12]。我们通过预实验发现Cd能够引起鸡胚睾丸氧化损伤，但其具体的生殖毒性机制和防御措施仍不清楚。

葡萄籽提取物原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)作为一种天然的食物源性抗氧化剂，可以有效清除自由基，具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗凋亡等生物学活性[13]。研究报道，GSPE能够通过抵抗机体的氧化应激和细胞凋亡，缓解硫酸镍导致的大鼠睾丸氧化损伤[14]，兔类固醇性骨坏死[15]和糖尿病大鼠肝脏的组织损伤[16]等，说明了GSPE本身具有良好的抗氧化作用。此外，褪黑素[17]、锌[18]和α-生育酚(维生素E)[19]等也有一定的缓解镉引起的机体氧化损伤的作用，但日常生活中摄取的含量远不能达到防治Cd致毒的效果。因此，探索Cd的致毒机制和有效的防御措施十分必要，而食源性GSPE是否对其有较好的缓解作用及其调节机制尚不清楚，值得进一步研究。

因此，本试验选用海兰鸡胚作为试验动物模型，使用一定剂量的Cd和适量GSPE，通过苏木素-伊红染色、生化检测、TUNEL细胞凋亡染色以及荧光定量PCR等方法，检测Cd对鸡胚睾丸损伤的毒性机制，并探索GSPE的缓解效果。这些结果将有助于提高人们对生殖健康和重金属Cd毒理学的认识，为缓解其毒性的进一步研究提供试验依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 主要仪器及试剂

仪器：轮转式石蜡切片机(HM340E，MICROM，German)，石蜡组织包埋机(EC-350，MICROM，German)，Real-time PCR 扩增仪(ABI7500，USA)，电子天平(AB104-N，Mettler-toledo 公司)，激光共聚焦显微镜(FV1000，Olympus，Japan)，分光光度计(OD-1000,Thermo,USA)，旋转孵化箱(Victoria SRL，Italy)，显微镜(Eclipse 80i，Nikon，Japan)。

试剂：氯化镉(CdCl2，99.99%，C116344，Aladdin，中国)，原花青素(GSPE，纯度≥ 95%，天津尖峰天然产物研究开发有限公司,中国)，反转录试剂盒(Thermo，Lithuania)，SYBR green RT-PCR kit(Takara，Japan)，DAPI(300 nM，Sigma Aldrich)，生化检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)，TUNEL细胞凋亡试剂盒(A112-03，南京诺唯赞生物科技有限公司，中国)。

1.1.2 试验动物及样品采集

试验鸡胚：海兰白鸡种蛋(59.8±2.5) g,购自杭州市蛋鸡试验场)，在旋转孵化箱中38.5 ℃和60%湿度的正常条件下孵化至所需的胚龄,在胚胎期第6.5 d(E6.5，即性腺分化后)注射0.05 mg·kg-1Cd或2.5 mg·kg-1GSPE，注射方法参照前人研究[18]，对照组注射0.9%的灭菌生理盐水，即分为对照组、Cd组、GSPE组和GSPE+Cd组。出壳时统计孵化率和睾丸指数，并对发育至出现典型曲精细管、精原细胞分层排布于管腔的E17.5的睾丸进行形态学观察、生化检测、凋亡染色和荧光定量PCR检测。

1.2 试验方法

1.2.1 孵化率和睾丸指数

对刚出壳小鸡进行孵化率的统计，同时，取材测睾丸指数(睾丸重/体重，mg·g-1)。

1.2.2 苏木素-伊红染色

4%中性多聚甲醛固定组织24 h，自来水缓慢冲洗过夜，70%～100%梯度酒精脱水，二甲苯：酒精(1：1)和二甲苯透明、浸蜡2 h后即可包埋，制作厚度为5 μm的石蜡切片，40 ℃水浴展片，60 ℃烘干2 h，100%～70%逐级酒精脱蜡后，用苏木素和伊红染色，二甲苯透明之后即可封片，在光学显微镜下，进行对组织的切片拍照和形态学观察分析。

1.2.3 生化指标的检测

取新鲜睾丸组织0.1～0.2 g放置于预冷的玻璃匀浆管内，按重量体积1:9的比例加入预冷的0.9%生理盐水，使用超声匀浆器进行研磨，当细胞完全破碎后将匀浆吸出，于4 000 r·min-1离心15 min，取出上清用于各项生化指标的检测，试剂盒检测丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.2.4 TUNEL染色

石蜡切片置于二甲苯中15 min，酒精逐级浸水，PBS清洗3次，每张片子滴加100 μL终浓度为20 μg·mL-1的Proteinase K工作液，室温孵育10 min。配制TUNEL检测液：按比例，每个样品分别取10 μL 5×Reaction Buffer,38 μL ddH2O，1 μL FITC-dUTP和1 μL TdT酶,混匀。在样品上加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min；DAPI染核8 min，封片，在激光共聚焦显微镜下观察、拍照并统计TUNEL阳性细胞。

1.2.5 RNA提取、cDNA合成及荧光定量PCR

根据Trizol说明书，提取睾丸组织的总RNA，提取的RNA立即用于反转录以免降解。cDNA的合成：加入已纯化的2 μg总RNA(具体体积根据测得的总RNA浓度计算)，1 μL Random引物，加水(nuclease-free)补足至12 μL，稍离心，于65 ℃反应5 min，之后，立即放置冰上冷却5 min至室温。然后，每孔加入5×缓冲液4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，10 mmol·L-1dNTP 混合物2 μL，反转录酶(200 U·μL-1)1 μL至20 μL体系，轻柔混匀离心，置于42 ℃，60 min温育；70 ℃，5 min终止反应。荧光定量PCR的扩增：将cDNA模板稀释20倍，反应体系为20 μL，即加入SYBR Premix Ex Taq (2X) 10.0 μL，PCR 上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II(50x) 0.4 μL，DNA模板2.0 μL和ddH2O 6.8 μL。反应条件是95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s和 60 ℃ 34 s 40个循环，最后95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s终止反应。表1为试验中所用引物序列。

1.3 数据处理

所得数据采用SAS(9.0 版本)软件进行方差分析和Duncan氏多重比较，用平均值±标准误差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果(Results)

2.1 原花青素和镉对孵化率和睾丸指数的影响

与对照组相比，Cd处理组孵化率和睾丸指数(睾丸/体重)均显著性降低(P<0.05)，GSPE联合后，鸡胚孵化率和睾丸指数有了明显升高(P<0.05)，见表2。

表1 Real-time PCR 所用引物Table 1 Primers for real-time PCR analyses

注: 睾丸指数为睾丸重/体重(mg·g-1)，n=100，同列不同的字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Testis index is testis weight/body weight (mg·g-1),n=100,a,bvalues with different letters in the same column were statistically different ( P<0.05).

2.2 原花青素和镉引起鸡胚睾丸形态的变化

图1显示GSPE组和对照组睾丸细胞形态正常，然而Cd处理组睾丸生精上皮遭到一定的破坏，核发生固缩，染色质周缘化，间质出现空泡状变化；但是，Cd +GSPE组从形态学上明显缓解了Cd导致的睾丸组织损伤。

2.3 原花青素和镉对睾丸氧化和抗氧化系统的影响

与对照组相比，H2O2和MDA含量均在Cd处理组明显升高 (P<0.05)，Cd处理组SOD活性和GSH含量都显著降低 (P<0.05)；GSPE组与对照组没有明显的区别；然而，Cd + GSPE组与Cd处理组相比，明显降低了MDA的含量 (P<0.05)，H2O2的含量也略有下降趋势，但差异不显著 (P>0.05)，同时，显著提高了SOD活性和GSH含量 (P<0.05)，见表3。

2.4 原花青素和镉对睾丸细胞凋亡的影响

图2显示，与对照组相比，镉处理组TUNEL阳性细胞明显增多(P<0.05)，GSPE联合后，GSPE + Cd组与Cd处理组相比，TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.05)，GSPE单独处理组与对照组无显著差别。

2.5 原花青素和镉对细胞凋亡和内质网应激相关基因表达的影响

图3为各组鸡胚睾丸的凋亡相关基因Bcl-2和Caspase3，内质网应激相关基因HO-1和XBP-1 mRNA的相对表达量。与对照组相比，镉处理组Bcl-2显著性降低(P<0.05，图3A)，Caspase3、HO-1和XBP-1 mRNA明显升高(P<0.05,图3B、3C和3D)。然而，与Cd处理组相比，GSPE + Cd组中Bcl-2显著性升高(P<0.05)，同时，Caspase3、HO-1和XBP-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

Cd作为现代工业和农业生产中危害较大的环境污染物之一，对人体和动物的健康造成严重威胁。有研究表明，Cd暴露能够导致发育阶段的胚胎生长缓慢或畸形[20]。Cd的剂量超过1微克/鸡胚时，随着剂量的增加孵化率显著降低[18]。2 mg·kg-1Cd暴露的小鼠睾丸发育异常，睾丸重量明显低于对照组[21]。本试验结果显示，Cd处理组鸡胚孵化率和睾丸重量均显著性下降，同时，联合GSPE促进了睾丸组织的生长发育。形态学上，HE染色结果表明镉引起了睾丸生殖上皮损伤，空泡化增多、细胞排列散乱等。GSPE + Cd组细胞形态与Cd处理组相比，趋于正常，生殖上皮较完整，细胞排列均匀，明显缓解了Cd的致毒作用，这一结果与党卫红[22]研究的水果蔬菜中抗氧化成分对Cd损伤的营养干预作用一致。可能的原因是，GSPE发挥了强有效的自由基清除功能，但GSPE的修复效果也会受到Cd的暴露剂量、毒性作用时间以及动物年龄等因素的影响。

表3 原花青素和镉对鸡胚睾丸氧化和抗氧化系统的影响Table 3 Effects of GSPE and Cd on oxidation and antioxidant system in chicken testis

注: n=110，同列不同的字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: n=110,a,bvalues with different letters in the same column were statistically different ( P<0.05).

图1 GSPE和Cd对睾丸形态学的影响 A:对照组，B: Cd组，C: GSPE组，D: Cd + GSPE组。

图2 GSPE和Cd对睾丸细胞凋亡的影响

图3 GSPE和Cd对睾丸细胞凋亡与内质网应激相关基因表达的影响 A: Bcl-2,B: Caspase3,C: HO-1,D: XBP-1

当内分泌干扰毒物进入机体后，往往引起自由基产生过多，组织内抗氧化体系耗竭，从而导致组织、器官损伤。为维护机体自身功能的正常运转和健康状态，体内有许多抗氧化物质如还原型GSH、维生素E、维生素C和各种抗氧化酶，如GSH-Px、SOD等，以抵抗各种活性氧和自由基产生的氧化损伤[4-7]。同时，MDA含量的测定，在一定程度上可以反映脂质过氧化损伤的程度，在外源性物质的刺激下，机体MDA和H2O2含量将会升高。本试验结果显示，Cd暴露导致了MDA和H2O2含量显著升高，SOD的活性明显降低，GSH含量也有一定的下降，继而导致凋亡细胞的增多，这一结果与Malgorzata等[11]发现的镉引起新生雏鸡血清抗氧化水平的变化和Bu等[23]研究的镉诱导小鼠睾丸损伤结果一致。然而，在联合GSPE后，睾丸的抗氧化水平有了显著的恢复，同时，镉诱导的凋亡细胞数量也有了明显减少。GSPE良好的缓解效果与另一种天然抗氧化产物槲皮素缓解Cd引起的睾丸损伤作用类似[23]。我们的研究结果表明，在本试验Cd暴露的剂量下，GSPE有效缓解了Cd引起的鸡胚睾丸氧化损伤和细胞凋亡。

内质网应激在机体氧化应激和细胞凋亡过程中发挥着重要的调节作用。近年来，研究发现镉暴露引起的氧化应激过程中，受到了内质网应激信号通路的调控[24]，同时，Ji等[25]发现N-乙酰半胱氨酸可通过抑制内质网应激，有效缓解了Cd诱导的睾丸生殖细胞凋亡。此外，内质网应激往往激活未折叠蛋白反应，其中XBP -1转录因子具有重要的调节作用。本试验也发现在Cd暴露的鸡胚睾丸组织中，细胞凋亡和内质网应激相关基因的表达变化密切相关，Cd处理组抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达明显降低，促凋亡基因Caspase3 mRNA表达水平显著升高；内质网应激XBP -1和HO -1 mRNA的表达水平同样明显升高。以上结果进一步表明，内质网应激在Cd导致的鸡胚睾丸细胞凋亡的过程发挥着重要作用。而且，联合GSPE后,GSPE +Cd组明显缓解了Cd诱导的细胞凋亡和内质网应激。另外，研究发现，抗坏血酸(维生素C)可以一定程度上缓解镉引起的内质网应激和睾丸损伤[26]，这与本试验结果类似。因此，GSPE可能通过XBP-1相关的内质网应激信号通路，发挥抗氧化的功能，缓解了氧化损伤,其具体作用机制还有待于进一步研究。

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◆

Ameliorative Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Cadmium-induced Testicular Oxidative Damage in Chicken Embryos

Hou Fuyin,Mi Junpeng,Liu Xingting,Li Jian,Mi Yuling*,Zhang Caiqiao#

College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

9 March 2015 accepted 13 May 2015

This study was conducted to explore the ameliorative effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on cadmium (Cd)-induced testicular oxidative damage in chicken embryos.Embryos of 6.5 days (E6.5) were injected with or without Cd (0.05 mg·kg-1) in the presence or absence of GSPE (2.5 mg·kg-1),then the hatchability and testis index were made statistically.Additionally,testicular morphology,parameters related to oxidative damage,apoptosis and the expression of endoplasmic reticulum (ER) stress related genes (XBP-1 and HO-1) mRNA were all measured at E17.5.The results showed that Cd exposure significantly reduced the hatchability and testis index,with the lesions of testis characterized by karyopyknosis,vacuolation and chromatin margination,compared with the control group.Cd exposure resulted in increased H2O2and malondialdehyde level,reduced superoxide dismutase activity and glutathione level,enhanced apoptotic cells in the testis as well.Meanwhile,Cd exposure also down-regulated Bcl -2 mRNA level,up-regulated the expression of caspase3,XBP -1 and HO-1 mRNA.However,GSPE supplementation attenuated the Cd-induced oxidative damage,along with the increase of hatchability and testis index,the improvement of antioxidant level and ER stress,the marked decrease of apoptotic cells,and the testicular morphology tended to be normal.In conclusion,GSPE via the antioxidative ability could ameliorate the Cd-induced testicular reproductive toxicity in chicken embryos by decreasing the expression of XBP-1 related ER stress genes mRNA.

cadmium; chicken embryo; testis; oxidative damage; proanthocyanidin

教育部新世纪项目(NCET-13-0519)；国家自然科学基金项目(31001041，31472160)

侯福银(1989-)，女，硕士研究生，研究方向为环境毒理与生殖内分泌学，E-mail: houfuyin2008@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: yulingmi@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150309008

2015-03-09 录用日期：2015-05-13

1673-5897(2015)4-138-08

X171.5

A

米玉玲(1975-)，女，副研究员，博士，博导，主要从事环境毒理学、动物生殖内分泌学方面的研究，发表学术论文40余篇。

侯福银，宓君鹏，刘兴廷,等.原花青素对镉引起的鸡胚睾丸氧化损伤的缓解作用[J].生态毒理学报，2015,10(4): 138-145

Hou F Y,Mi J P,Liu X T,et al.Ameliorative effect of grape seed proanthocyanidin extract on cadmium-induced testicular oxidative damage in chicken embryos [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 138-145 (in Chinese)

张才乔(1965-)，教授，博士，博导，主要从事卵泡发育和闭锁调节、环境内分泌干扰物生殖毒理相关研究，发表学术论文100余篇。