酰胺及其酯类表面活性剂对矿物润滑油基础油生物降解性的影响

韦友亮，陈波水，王 九，张 楠，方建华，吴 江

（后勤工程学院 军事油料应用与管理工程系，重庆 401311）

酰胺及其酯类表面活性剂对矿物润滑油基础油生物降解性的影响

韦友亮，陈波水，王 九，张 楠，方建华，吴 江

（后勤工程学院 军事油料应用与管理工程系，重庆 401311）

以液体石蜡模拟矿物润滑油基础油，分别将脂肪酸酰胺、脂肪酸二乙醇酰胺、脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯（FEAP）表面活性剂加入液体石蜡中，通过测定生物降解指数（BDI），考察表面活性剂对液体石蜡生物降解性的影响；通过测定培养液的光密度和油水界面张力，考察表面活性剂促进液体石蜡生物降解的作用机制。实验结果表明，3种酰胺及其酯类表面活性剂均可显著提高液体石蜡的生物降解性，FEAP的效果最好，在液体石蜡中加入1.0%（w） FEAP时，可使液体石蜡的BDI由33.0%提高至71.9%；酰胺及其酯类表面活性剂能显著降低培养液油水界面张力和加速微生物生长，从而促进液体石蜡的生物降解。

脂肪酸酰胺类表面活性剂；矿物润滑油基础油；生物降解；脂肪酸酰胺；脂肪酸二乙醇酰胺；脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯

矿物润滑油是当前乃至今后较长时间内应用最广泛的润滑剂品种之一。在使用过程中，不可避免地会通过泄露、飞溅、蒸发、包装用品残留、回收不当等途径进入环境，因其生物降解性差［1］，严重污染土壤和水资源，破坏生态环境和生态平衡。目前，治理石油烃类污染采取的方法有石油烃稀释、迁移等物理方法和萃取、化学氧化等化学方法，这些方法难将石油烃彻底降解，且易造成二次污染。生物修复方法具有安全、经济性强和无明显二次污染等显著优点，越来越受到人们的关注。

环境微生物学的研究表明，某些含氮和/或磷等元素的化合物可加快微生物繁殖，增强其活性，促进难降解化合物的生物降解［2-4］。自然环境中，氮源和磷源经常是烃类化合物生物降解的重要限制因素。鉴于此，在矿物润滑油中设计添加含氮和/或磷等元素的表面活性化合物，可望有效改善其生物降解性，实现润滑油污染环境的“主动”生物修复。陈波水课题组［5-9］率先开展研究，表明在矿物基础油和矿物成品油中添加氨基酸、酰胺等含氮和/或含磷的化合物，可明显改善润滑油的生物降解性，并且还可有效改善润滑油的相关使用性能。

本工作以液体石蜡模拟矿物润滑油基础油，研究了脂肪酸酰胺（FAA）、脂肪酸二乙醇酰胺（FDEA）、脂肪酸乙醇酰胺磷酸酯（FEAP）3种酰胺及其酯类表面活性剂对液体石蜡生物降解性的影响。

1 实验部分

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料

油酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；液体石蜡：分析纯，上海华灵康复器械厂；FAA，FDEA，FEAP：实验室制备；实验用水为去离子水，自制。

1.1.2 菌株

所选菌株分别为假单胞菌属、苍白杆菌属、博德特式菌属和戈登氏菌属。4株菌种系从油污染土壤中富集培养、分离和鉴定，并被证实具有降解润滑油的作用［10］。菌种用甘油冷冻保藏法于-70 ℃下保存，备用。

1.1.3 培养基

1）LB液体培养液：将胰蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g置于500 mL锥形瓶中，用5 mol/L 的NaOH溶液调节pH=7.0，用去离子水定容至300 mL，用121 ℃的蒸汽灭菌15 min。

2）无机盐培养液：将NaCl 0.05 g，NH4NO30.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.05 g，CaCl20.25 g，KH2PO40.25 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g置于1 000 mL锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，用121 ℃的蒸汽灭菌15 min。

1.1.4 仪器

BS-1E型振荡培养箱：金坛市富华仪器有限公司；L535-1型离心机：长沙湘仪仪器有限公司；HARKE-DWK型自动界面张力仪：北京哈科试验仪器厂；TU-1950型紫外-可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 菌悬液的配制

采用湿重法配制菌悬液作为生物降解实验的接种微生物。在LB平板上用反复平板划线法分别将4株菌株复活，挑单菌落于LB液体培养基中，置于温度（30±2）℃、转速200 r/min的恒温振荡培养箱中培养36 h，再于转速8 000 r/min下离心分离6 min，去上层清液，称菌体湿重。用0.85%（w）无菌生理盐水配制10%（w）菌悬液。量取单菌株菌悬液各2.5 mL，混合后组成混合菌悬液（10 mL）。

1.3 生物降解性的测定

以液体石蜡模拟矿物润滑油基础油，考察表面活性剂对生物降解液体石蜡的影响。在液体石蜡中分别加入1.0%（w）的FAA，FDEA，FEAP作为加表面活性剂的试样。以加表面活性剂试样、空白试样（液体石蜡）和基准物（油酸）作为受试物，以混合菌悬液作为接种微生物。

采用生物降解性测定方法［11］测定各受试物的生物降解性。该方法以生物降解指数（BDI）（BDI定义为相同条件下受试物降解生成CO2的量与基准物降解生成CO2的量的比值）作为指标评定受试物的生物降解性。BDI值越大，生物降解性越好。实验时间12 d，温度（30±2） ℃。每隔2 d测定一次CO2的生成量，并计算各受试物CO2生成量的变化，一种受试物进行3次重复测定，取3次测定的平均值作为CO2的生成量的测定结果，由CO2生成量累计值计算BDI。

1.4 微生物生长变化及界面张力的测定

分别将FAA（0.002 5 g）、FDEA（0.002 5 g）、FEAP（0.002 5 g）与液体石蜡（0.25 g）、混合菌悬液（2.5 mL）加入到pH=7.0的500 mL无机盐培养液中，置于温度（30±2）℃、转速200 r/min的恒温振荡培养箱中培养12 d。

培养液培养过程中每隔2 d取样一次（取样150 mL），采用紫外-可见光分光光度计在600 nm 波长处测定培养液的光密度（D（600））；培养液经转速4 000 r/min 离心分离10 min后取上层清液，采用自动界面张力仪测定其油水界面张力［12］。每次测定结束后，将所取试样倒回对应的锥形瓶，置于恒温振荡培养箱中继续培养。

2 结果与讨论

2.1 表面活性剂种类对液体石蜡生物降解性的影响

2.1.1 表面活性剂种类对CO2生成量的影响

表面活性剂种类对液体石蜡生物降解过程中CO2生成量的影响见图1。由图1可见，添加表面活性剂时，液体石蜡在生物降解过程中CO2生成量明显增加；液体石蜡在生物降解过程中CO2生成量随时间的变化曲线均呈现波浪型分布；添加FEAP时，液体石蜡在生物降解过程中CO2生成量最大。这是因为酰胺或其酯类表面活性剂提供了磷、氮营养物质，促进了微生物的生长；液体石蜡是一种碳数分布在12～22且结构组分较为复杂的混合物［13］，为降解菌提供了不同组分的碳源，另外由于微生物对石油烃类物质的利用率与其结构密切相关［14］，因此CO2生成量出现的两个波峰是由于两种结构不同且含量较高的碳源被降解菌先后降解所致。

图1 表面活性剂种类对液体石蜡生物降解过程中CO2生成量的影响Fig.1 Effects of surfactants on the CO2production（mCO2） in the biodegradation of liquid paraffi n.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；Fatty acid diethanol amide（FDEA）；Fatty acid amide（FAA） ；Fatty acid ethanol amide phosphate（FEAP）

2.1.2 表面活性剂种类对液体石蜡BDI的影响

表面活性剂种类对液体石蜡BDI的影响见图2。由图2可见，在实验周期内，加表面活性剂液体石蜡的BDI明显大于未加表面活性剂的液体石蜡，这说明FAA，FDEA，FEAP 3种表面活性剂均可促进液体石蜡的生物降解。其原因可能是液体石蜡中的烃类与表面活性剂中的疏水基团相互作用，使油水界面张力降低，油水界面面积增大，微生物与液体石蜡中烃类的接触机会增多，从而提高了生物降解率。在添加量同为1.0%（w）的情况下，3种酰胺及其酯类表面活性剂促进液体石蜡生物降解效果的差距较大，BDI依次为：FEAP 71.9%，FAA 68.3%，FDEA 56.0%。

图2 表面活性剂种类对液体石蜡BDI的影响Fig.2 Effects of the surfactants on the biodegradation index（BDI） of liquid paraffi n.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA ；FEAP

研究结果表明，表面活性剂的生物降解性与其自身结构有关，主要由疏水基团决定，并随疏水基线性程度的增强而增加［15］。3种酰胺及其酯类表面活性剂结构中均含有疏水基团酰胺基，在同等添加量下，FDEA结构中酰胺基氢原子被醇烷基取代，使得疏水基的线性程度减弱，导致其生物降解性降低，可能影响微生物对其利用，所以促进液体石蜡的降解效果比FAA差。细菌表面总是带负电，溶液中由于静电力作用，阳离子易吸附到细菌表面，影响细菌的正常生理活动，从而对细菌生长造成一定程度的危害［16］。FEAP是阴离子表面活性剂，在溶液中电离为带负电的离子，不易吸附于细菌表面，可能更利于生物降解；此外，相比于FAA 和FDEA，FEAP可同时提供磷和氮两种营养物质，可能使其更好地被微生物利用，故促进降解的效果最好。这也是加不同的表面活性剂时，液体石蜡在生物降解过程中CO2生成量不同的原因。

2.2 表面活性剂对生物降解的促进作用

2.2.1 改变油水界面张力

表面活性剂对培养液油水界面张力的影响见图3。由图3可见，加表面活性剂培养液的油水界面张力总体上低于未加表面活性剂的培养液。这表明3种酰胺及其酯类表面活性剂均能降低培养液的油水界面张力。

通过对烃类化合物乳化和假增溶作用，提高烃类化合物的生物可利用率［17］。微生物在生长过程中，为适应环境往往生成多种结构形式的生物表面活性剂［18］，生物表面活性剂可通过分散和增溶两种途径提高有机物的生物可利用率［19］。由图3可见，在第6 d，加表面活性剂培养液的油水界面张力下降明显，这可能正是因为微生物生长进入稳定期，产生了生物表面活性剂，进一步降低了油水界面张力，从而增大油水界面面积，增加微生物与较大油滴之间的直接接触，提高了微生物对有机物的生物可利用率。

图3 表面活性剂对培养液油水界面张力的影响Fig.3 Effects of surfactants on the oil-water interfacial tensions（F） of cultured broths.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA ；FEAP

2.2.2 促进微生物的生长

在降解烃类化合物的过程中，微生物数量对降解速率有很大影响，其增长率最快时期最有利于降解烃类化合物［20］。添加表面活性剂培养液的D（600）随降解时间的变化见图4。

图 4 添加表面活性剂培养液的D（600）随降解时间的变化Fig.4 Optical density（D（600）） of the cultured broths containing the surfactants vs. biodegradation duration.Conditions：（30±2）℃，surfactant dosage 1.0%（w）.Blank；FDEA；FAA；FEAP

从图4可见，未加表面活性剂培养液的D（600）随降解时间的延长而增大，在第4 d进入对数生长期，至第6 d后趋于稳定，进入静止期；加表面活性剂培养液的D（600），随降解时间的延长先增大后降低而后再增大，呈现波浪型变化，在第2 d就进入对数生长期，其原因是酰胺及其酯类表面活性剂含有的磷、氮营养物质促进了微生物生长，但当营养物质消耗不能满足微生物生长时，微生物进入衰亡期，致使D（600）减小，微生物经过调整其生长再次活跃并最终趋于稳定，这与图3中油水界面张力的变化规律相一致。

3 结论

1）液体石蜡中加入FAA，FDEA，FEAP，均可显著促进液体石蜡的生物降解，FEAP的促进降解效果最好，其次为FAA，第3为FDEA。

2）在液体石蜡生物降解过程中，表面活性剂能有效降低油水界面张力，使微生物与烃类化合物接触机会增多，促进微生物对烃类化合物的利用率。

3）在液体石蜡生物降解过程中，酰胺及其酯类表面活性剂为微生物生长提供必需的磷、氮元素，对微生物的生长和繁殖起到促进作用。

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（编辑 李治泉）

Effects of Fatty Amide Type Surfactants on Biodegradability of Mineral Lubricant Base

Wei Youliang，Chen Boshui，Wang Jiu，Zhang Nan，Fang Jianhua，Wu Jiang
（Department of Oil Application & Management Engineering，Logistical Engineering University，Chongqing 401311，China）

The effects of three fatty amide type surfactants，namely fatty acid amide，fatty acid diethanol amide and fatty acidic ethanol amide phosphate（FEAP），on the biodegradation of liquid paraffi n which was used as simulated mineral lubricant base were investigated by the determination of the biodegradation index（BDI）. The infl uences of the amide type surfactants on the biodegradation of liquid paraffin were researched through measuring the optical density and oil-water interfacial tension of the cultured broths by means of ultraviolet-visible spectrophotometer and interfacial tension instrument. The results indicated that the biodegradability of liquid paraffi n was markedly improved by adding the surfactants among which FEAP was the best. The biodegradability of liquid paraffin increased from 33.0% to 71.9% by the addition of 1.0%（w） FEAP. Through the addition of the amide type surfactants，the oil-water interfacial tensions of the cultured broths were decreased obviously and the growth of microbes was promoted，which could improve the biodegradation of liquid paraffi n.

fatty amide type surfactants；mineral lubricant base；biodegradation；fatty acid amide；fatty acid diethanol amide；fatty acid ethanol amide phosphate

1000 - 8144（2015）06 - 0748 - 05

TE 626.3

A

2014 - 12 - 22；［修改稿日期］ 2015 - 02 - 24。

韦友亮，男，湖北省黄冈市人，硕士生，电话 18523690127，电邮 18523690127@163.com。联系人：陈波水，电话13883692917，电邮 boshuichen@163.com。

国家自然科学基金项目资助（50975282）。