糖调节受损大鼠学习记忆能力下降与海马神经细胞凋亡有关

赵 岚，董银华，王洪新，梁佩芬

（天津市第四中心医院神经内科，天津 300140）

糖调节受损大鼠学习记忆能力下降与海马神经细胞凋亡有关

赵 岚，董银华，王洪新*，梁佩芬

（天津市第四中心医院神经内科，天津 300140）

目的 探讨糖调节受损大鼠海马神经细胞凋亡与学习记忆能力的关系。方法 用高脂高糖饲料饲养法建立糖调节受损大鼠模型;用Morris水迷宫法检测学习记忆能力;用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡数目;用免疫组化和原位杂交技术检测海马神经细胞Bcl-2/Bax和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的表达。结果 与NGT组相比，IGR组学习记忆能力下降（P＜0.05），海马神经细胞凋亡数增高（P＜0.05），Bcl-2、Bcl-2 mRNA表达减少（P＜0.05），Bax与Bax mRNA表达增加（P＜0.05）。IGR组学习、记忆能力与Bcl-2阳性表达呈正相关（P＜0.05），与Bax阳性表达呈负相关（P＜0.05）。结论 糖调节受损与大鼠学习记忆能力下降有相关性，海马神经细胞凋亡可能是其重要机制之一。

糖调节受损;学习记忆;神经细胞凋亡;海马

随着人们生活水平的提高，糖尿病患者逐年增加。糖尿病脑病作为糖尿病中枢神经系统并发症主要表现为学习、记忆能力及解决问题能力的下降。目前国内外对于糖尿病脑病的研究较多，血糖增高诱导氧化应激反应引起中枢神经细胞凋亡可能是其发病机制之一［1］。糖调节受损是糖尿病的前期状态，约1/3患者会转变为糖尿病。糖调节受损作是否会导致患者学习记忆能力下降，目前尚无明确报道。本研究通过建立糖调节受损大鼠模型，从凋亡机制角度探讨糖调节受损与学习记忆减退的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级Wistar雄性大鼠，体质量180～220 g［天津医科大学实验动物中心提供，许可证号:SYXK（津）2009-0001］;高脂高糖饲料（猪油10%，胆固醇1.2%，胆盐0.2%，果糖15%，蛋黄粉10%，余为基础饲料）;末梢血糖仪及试纸、TUNEL检测试剂盒（罗氏公司）;Morris水迷宫及水迷宫记录分析系统（中国医学科学院药物研究所研制）;免疫组化和原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）;DAB显色剂（北京中山公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备:Wistar大鼠适应性喂养1周后随机分成对照组（NGT组）和糖调节受损组（IGR组），每组40只。实验组给予高脂高糖饲料。两组大鼠每日均喂食3次，按每只20 g/日投放饲料，共饲养20周。从第5周开始，每两周进行1次葡萄糖耐量试验［2］。糖调节受损大鼠造模成功标准为空腹血糖6.2～7.5 mmol/L或者餐后2 h血糖7.9～10.4 mmol/L［3］。

1.2.2 行为学检测:NGT组和IGR组分别于饲养5、10、15 和20 周，用 Morris水迷宫法［4］对大鼠进行学习记忆功能测定。第1天至第4天记录大鼠在水池内任一入水点返回隐藏平台所需时间（隐藏平台获得实验），作为学习成绩;第5天撤去隐藏平台后，记录大鼠在水池任一位置入水后2 min内通过原平台位置的次数（空间搜索实验），作为记忆成绩。每个时间点训练10只大鼠。

1.2.3 大鼠脑组织石蜡切片:大鼠海马组织石蜡包埋后切片，厚度5 μm。每个时间点选取10只大鼠，为相同时间点进行水迷宫实验的大鼠。具体步骤见参考文献［5］。

1.2.4 原位末端标记法（TUNEL法）检测大鼠海马神经细胞凋亡数目:严格按照试剂盒说明书提示步骤进行操作。TUNEL阳性细胞即凋亡细胞为在显微镜下观察细胞核中有棕黄色颗粒者。阳性反应的细胞定量采用Imane-Proplus软件系统，每只大鼠取海马平面切片中相互不重叠的5个视野，在400倍视野下计数阳性细胞平均个数。

1.2.5 免疫组化法和原位杂交法检测大鼠海马神经细胞中Bcl-2/Bax和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的表达:操作步骤严格按试剂盒说明书进行。显微镜下观察所有染色切片，阳性细胞标志为组织切片中胞核或胞质染黄色或黄棕色者。每张切片在显微镜200倍视野下选5个互不重叠视野，以平均吸光度值反映表达情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，对大鼠海马神经细胞Bcl-2/Bax阳性表达及认知功能进行Pearson相关分析。

2 结果

2.1 糖调节大鼠成模情况

IGR组大鼠成模率于12周时为60%，15周时为100%。

2.2 一般观察

与NGT组相比，IGR组大鼠饲养15周和20周时学习记忆能力显著下降（P＜0.05，P＜0.01）（表1，2）。

2.3 大鼠海马神经凋亡细胞计数

与NGT组相比，IGR组大鼠饲养15周和20周时海马神经细胞凋亡显著增加（P＜0.05，P＜0.01）（图 1，表 3）。

2.4 大鼠海马神经细胞Bcl-2和Bax免疫组化表达情况

与NGT组相比，IGR组大鼠饲养15周和20周时海马神经细胞Bcl-2表达显著下降，Bax表达显著增加（P＜0.05，P＜0.01）（图2，3，表4）。

表1 大鼠隐藏平台获得实验Table 1 Hidden platform for experiment in rats（x ± s，s，n=10）

表2 大鼠空间搜索实验Table 2 Space search experiment in rats（x ± s，s，n=10）

图1 饲养20周后，NGT组与IGR组大鼠海马组织凋亡细胞比较Fig 1 Comparison of apoptosis of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

表3 大鼠海马神经细胞凋亡细胞计数Table 3 Apoptosis of rat hippocampal cells in two groups（x ± s，s，n=10）

2.5 大鼠海马神经细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA原位杂交表达情况

图2 饲养20周后，NGT组与IGR组大鼠海马组织Bcl-2表达比较Fig 2 Expressions of Bcl-2 of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

图3 饲养20周后，NGT组与IGR组大鼠海马组织Bax表达比较Fig 3 Expressions of Bax of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

与NGT组相比，IGR组大鼠饲养15周和20周时海马神经细胞Bcl-2 mRNA表达显著下降，Bax mRNA表达显著增加（P＜0.05，P＜0.01）（图4，5，表5）。

表4 两组大鼠不同时间点海马神经细胞Bcl-2和Bax表达Table 4 Bcl-2/Bax expression in two groups of rats hippocampal nerve cells at the different time points（x ± s，A value，n=10）

图4 饲养20周后，NGT组与IGR组大鼠海马组织Bcl-2 mRNA阳性表达Fig 4 Expressions of Bcl-2 mRNA of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

图5 饲养20周后，NGT组与IGR组大鼠海马组织Bax mRNA阳性表达Fig 5 Expressions of Bax mRNA of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

表5 两组大鼠不同时间点海马神经细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达Table 5 Bcl-2 mRNA/Bax mRNA expression in two groups of rats hippocampal nerve cells at the different time points（x ± s，A value，n=10）

2.6 Bcl-2/Bax的表达水平与认知之间的关系

IGR组大鼠学习记忆成绩与Bcl-2阳性表达水平呈正相关（P＜0.05），与Bax阳性表达水平呈负相关（P＜0.05）。

3 讨论

海马组织是大脑的重要组成部分。目前已知对于人和大鼠而言，海马是学习、记忆的重要解剖基础和神经中枢。其中海马CA1区神经元与空间学习记忆密切相关［6］，故海马CA1区神经细胞任何形式的损伤都可能会导致以学习和记忆为主的认知功能减退。国内有学者报道［7］，海马神经细胞凋亡是导致糖尿病或非糖尿病性认知障碍的可能原因。

糖调节受损（impaired glucose regulation，IGR）包括空腹血糖受损（impaired fasting glucose，IFG）和糖耐量损害（impaired glucose tolerance，IGT）两种情况，是正常血糖与糖尿病之间的一种代谢异常状态，是糖尿病的高危人群。有研究［8］表明，60岁以上老年患者中血糖升高者其杏仁核与海马体积萎缩，提示在尚未达到糖尿病水平之前，血糖异常升高可能已经对海马组织的形态及功能产生影响。本研究发现在糖调节受损大鼠造模成功15周后大鼠的学习、记忆能力较对照组明显降低，提示持续血糖升高是导致学习记忆能力下降的重要因素。

凋亡是细胞的程序性死亡，是多基因严格控制的过程。Bcl-2基因家族是细胞凋亡过程中的代表性基因家族之一，Bcl-2/Bax作为功能上相对立的凋亡调控基因已被深入研究。目前研究［9］表明，Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因，只表达在肯定存活的神经元上。Bax蛋白在细胞内膜、细胞质、细胞核处有表达，对Bcl-2有拮抗作用。当Bcl-2相对量大于Bax时，Bcl-2同源二聚体增多，促进形成Bcl-2-Bax异源二聚体，二者均可抑制细胞凋亡［10］。有动物实验［11-13］表明，高血糖可启动凋亡机制，促进凋亡蛋白的表达，进而促进脑细胞的凋亡。本研究发现糖调节受损大鼠造模成功15周后海马神经细胞凋亡明显增加，且与大鼠学习记忆能力减退明显相关，提示血糖增高导致的海马神经细胞凋亡增加是导致学习记忆能力下降的原因之一。

综上所述，本研究认为糖调节受损作为糖尿病前期状态已经可以引起学习记忆能力减退，细胞凋亡是重要机制。提示在临床工作中，不仅要积极预防糖调节受损向糖尿病转化，也要预防其导致患者学习记忆能力减退的不利影响。探讨如何抑制海马神经细胞凋亡，可以作为防治糖调节受损学习记忆能力减退的重要靶点。

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The relationship between learning/memory ability and neural cell apoptosis in hippocampal of rats with impaired glucose regulation

ZHAO Lan，DONG Yin-hua，WANG Hong-xin*，LIANG Pei-fen
（Dept.of Neurology，the Fourth Central Hospital in Tianjin，Tianjin 300140，China）

ObjectiveTo identify the relationship between impaired glucose regulation of neuronal apoptosis in hippocampus and the ability of learning/memory in rats.MethodsThe model rats were made by high fat and sugar diet;The morris water maze was used to detect the learning and memory function;The TUNEL method was used to detect neuronal apoptosis in hippocampus.Expression of Bcl-2/Bax and Bcl-2 mRNA/Bax mRNA factor in hippocampus neurons was detected with immunohistochemistry andin situhybridization.ResultsCompared with NGT group，in IGR group the learning and memory ability were meaningfully decreased（P＜0.05）;the number of neuronal apoptosis in hippocampus was increased significantly（P＜0.05）;the expression of Bcl-2 and Bcl-2 mRNA in hippocampus decreased significantly（P＜0.05）;the expression of Bax and Bax mRNA in hippocampus increased significantly（P＜0.05）;The ability of learning and memory was positively correlated with expression of Bcl-2（P＜0.05）and negatively correlated to the expression of Bax（P＜0.05）.ConclusionsThere is a relationship between impaired glucose regulation and the ability of learning and memory in rats，its mechanism may be potentially related to hippocampal neuronal apoptosis.

impaired glucose regulation;learning and memory;neuronal apoptosis;hippocampus

R741.02

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.017

1001-6325（2015）09-1232-05

2015-03-05

2015-05-28

天津市卫生局基金（2012KZ015）

*通信作者（corresponding author）:wh1963919@163.com