沉默Smo基因对大鼠原代软骨细胞增殖与凋亡的影响

朱志坚，于燕妮，陶 欣，邓超男

（贵州医科大学病理教研室，贵州贵阳 550004）

沉默Smo基因对大鼠原代软骨细胞增殖与凋亡的影响

朱志坚，于燕妮*，陶 欣，邓超男

（贵州医科大学病理教研室，贵州贵阳 550004）

目的 观察沉默Smo基因后对大鼠原代软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法 用机械-酶消化法获取原代大鼠软骨细胞，经免疫细胞化学Ⅱ型胶原（ColⅡ）鉴定后，将实验分为对照组、control siRNA组和SmosiRNA 1～3组，以慢病毒为载体将siRNA转入软骨细胞，72 h后，MTT法检测细胞活力;反转录PCR（RT-PCR）及蛋白印迹（Western blot）检测Smo的表达量;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 各组序列经慢病毒载体成功转染到原代软骨细胞中，SmosiRNA1～3均不同程度的抑制Smo的表达，以SmosiRNA2组最为明显，其mRNA及蛋白的表达分别为0.19±0.03和0.39±0.07;同时，SmosiRNA2组细胞活力最低（77.38% ±7.19%）而凋亡率最高（21.43% ±2.97%）。结论 沉默Smo可抑制原代软骨细胞增殖，并诱导软骨细胞凋亡，Smo具有保护软骨细胞免遭凋亡的作用。

原代软骨细胞;慢病毒载体;siRNA;凋亡;增殖

Hh信号通路是一条经典的胚胎发育和分化信号系统，在胚胎发育过程中对细胞分化和增殖起重要作用，同时可以促进许多成熟器官创伤愈合。7次跨膜蛋白（Smoothened，Smo）为Hh信号通路上的膜蛋白，是Hh信号通路的转换器，对Hh信号传导至关重要，可以把细胞外的Hh信号转换成细胞内Gli（神经胶质瘤关联癌基因同源物，glioma assocuated oncogene homolog，Gli）信号，引发细胞内信号下传，激活转录因子 Gli［1］，从而激活下游的靶基因。研究发现，软骨细胞内有Smo的表达［2-3］，但对软骨细胞的生长产生何种作用的研究相对少见，本实验应用RNA干扰技术（siRNA）沉默Smo基因，观察沉默后软骨细胞增殖与凋亡的情况，探讨Smo对体外培养的原代软骨细胞生长的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SD乳鼠［清洁级，贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号:ISCXK（黔）2012-0001］;胎牛血清、低糖DMEM培养基（Hyclone公司）;胰蛋白酶（Thermo公司）;Ⅱ型胶原蛋白酶（Sigma公司）;含干扰序列慢病毒液（上海吉玛公司包装合成）;促转染试剂Polybrene（Sigma公司）;MTT（北京鼎国公司）;兔抗鼠ColⅡ多克隆抗体（武汉博士德公司）;兔抗鼠 Smo、Bcl、Bax多克隆抗体（Santa Cruz公司）;SP-9000免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），Annexin V-FITC/PI（Invitrogen公司）;RIRA裂解液、PMSF（上海碧云天生物技术有限公司）;辣根酶标记山羊抗兔IgG和SDS-PAGE试剂等（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 软骨细胞的分离及鉴定:取大鼠膝关节软骨组织，软骨细胞的分离及培养参照文献［4］。采用II型胶原（Col II）免疫组织化学方法对其细胞进行鉴定，步骤参照试剂盒说明书。

1.2.2 分组与处理:将软骨细胞以每孔2×105个接种于6孔板，实验设空白对照组、control siRNA组、SmosiRNA1～3组，每组6个平行样，将带有siRNA的慢病毒感染软骨细胞，同时在每孔加入促转染试剂Polybrene（5 mg/L）以促进感染率，72 h后通过倒置荧光显微镜观察细胞内荧光蛋白的表达，并计算病毒感染效率，感染效率（%）=荧光视野下细胞数/普通视野下细胞数×100%。control siRNA序列为:5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3'，SmosiRNA1序列为:5'-GCATCTGCTTTGTAGGCTACA-3'，SmosiRNA2 序列为:5'-GCAAGATCAATGAGACC ATGC-3'，SmosiRNA3 序列为:5'-GCTCGAAGAGG AGCCATATTA-3'，序列片段均由上海吉玛技术有限公司提供合成。

1.2.3 MTT法检测细胞活力:取生长状态良好的软骨细胞，按5×103个细胞/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，感染软骨细胞72 h后，弃掉各孔培养基并加入新鲜培养基 200 μL，再加入 20 μL（5 g/L）的噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），继续孵育4 h;弃培养液，每孔加150 μL二甲基亚砜，振荡混匀，用酶标仪于490 nm波长处测其吸光度（A）值，细胞的增殖活性（%）=（A转染组－A空白组）/（A对照组－A空白组）×100%。

1.2.4 RT-PCR检测SmomRNA表达水平:转染72 h后参照RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录成cDNA后进行Smo基因扩增。引物由上海生工公司合成，Smo上游引物:5'-AAGAAGAAGCGG AGGAAGAGG-3'，下游引物:5'-AGG GGCAGAGTGG TGAAGTT-3';β-actin上游引物:5'-CGTAAAGACC TCTATGCCAACA-3'，下游引物:5'-AGCCACCAA TCCA CACAGAG-3'。PCR 反应体系 20 μL，反应条件:94℃ 2 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统进行扫描分析。

1.2.5 Western blot检测 Smo、Bax、Bcl-2 的表达:转染72 h后，提取细胞总蛋白，蛋白定量后经10%SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜上，依次加人封闭液、兔抗鼠 Smo、Bcl、Bax 多克隆抗体（1∶200）、辣根酶标记山羊抗兔IgG（1∶3 000），再经化学发光剂反应，X线片压片曝光。将曝光后的条带扫描并用Image J分析数据，以相应蛋白条带的平均吸光度值表示所测蛋白的相对强度。以β-actin蛋白条带作为内参照，最后数据以蛋白质表达的相对水平比来表示。

1.2.6 Smo沉默后细胞凋亡的检测:根据Western blot及RT-PCR结果选出最适SmosiRNA干扰片段，将实验分3组:对照组;control siRNA组;SmosiRNA2组。转染72 h后，胰蛋白酶消化收集细胞，对细胞进行Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。

图2 慢病毒感染软骨细胞Fig 2 Chondroncytes transfected with lentivirusin（×100）

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原代软骨细胞形态及鉴定

原代软骨细胞呈三角形、梭形、多角形或不规则形，胞质丰富，核大而圆，可见多个核仁（图1A）。ColⅡ免疫组化发现软骨细胞胞质内被染成棕黄色颗粒（图1B）。

图1 原代软骨细胞形态及鉴定Fig 1 The morphological characteristics and the identify result of primary chondrocyte（×100）

2.2 软骨细胞慢病毒感染结果（图2）

2.3 干扰后细胞增殖活力

SmosiRNA2及SmosiRNA3组细胞活力低于对照组及control siRNA组（P＜0.05），SmosiRNA1组细胞活力与对照组及control siRNA组无明显差异（表1）。

2.4 干扰后Smo基因mRNA表达

control组、control siRNA 组、SmosiRNA1～3组SmomRNA表达量分别为0.31±0.03、0.32±0.02、0.29±0.04、0.19±0.03、0.25 ±0.03。SmosiRNA2组及SmosiRNA3组SmomRNA的表达量明显低于与对照组及control siRNA组（P＜0.05）（图3）。

表1 转染后细胞活力Table 1 The cell viability of chondroncytes after transfected with lentivirus in different groups（x ± s，n=6）

图3 转染后软骨细胞Smo mRNA表达Fig 3 Expression of Smo mRNA of rat chondroncytes after transfected in different groups

2.5 干扰后Smo基因蛋白表达情况

SmosiRNA1～3均可不同程度地抑制Smo的表达，以SmosiRNA2表达量最低（P＜0.05）（图4，表2）。

图4 转染后软骨细胞Smo、Bcl-2、Bax蛋白表达Fig 4 Expression of Smo，Bcl-2 and Bax protein of rat chondroncytes after transfected in different groups

表2 转染后大鼠软骨细胞 Smo、Bcl-2及Bax平均吸光度值Table 2 Average absorbance value of Smo，Bcl-2 and Bax of rat chondroncytes after transfected in different groups（x ± s，n=6）

2.6 细胞凋亡

对照组、control siRNA组及SmosiRNA2组细胞凋亡率分别为9.63% ±1.94%、13.90% ±2.88%和21.43%±2.97%。SmosiRNA2组细胞凋亡率明显高于其余两组（P＜0.05）（图5）。

3 讨论

Smo蛋白由原癌基因Smothened编码，是Hh信号传递所必须的受体，在Hh信号通路介导的细胞增殖及凋亡起着重要调节作用。当Hh蛋白缺乏时，Smo蛋白与Ptc结合，从而抑制Smo的活性;当Hh蛋白存在时，Ptc与Hh结合，解除对Smo的抑制作用，激活后的Smo可以将胞外Hh信号转换成胞内Gli信号，进而激活Hh信号通路的下游Bcl-2、CyclinD等因子的表达，调节细胞的增殖与凋亡［5］。本实验应用RNA干扰技术沉默Smo因子，以了解Smo对原代软骨细胞增殖与凋亡的作用。由于软骨细胞可以特异性分泌Ⅱ型胶原［6］，故本实验采取机械-酶消化法获取细胞后，应用ColⅡ染色的方法对其鉴定，结果显示细胞的胞质内被染成棕黄色，提示原代软骨细胞分离成功。

图5 软骨细胞凋亡Fig 5 The results of chondrocyte apoptosis in different groups

目前，转染载体主要分为病毒载体和非病毒载体。由于慢病毒对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合实验中难于转染的细胞，并且具有RNA干扰作用时间持久，免疫原性小等优点［7-8］，为此，本实验采用慢病毒作为载体进行转染，该实验中的3组siRNA是针对大鼠Smo基因序列不同位点特异性设计并合成的，通过病毒载体将3对siRNA分别转染到体外培养的原代软骨细胞内，并设立阴性对照组评价转染效率。转染72 h后通过提取RNA及蛋白发现SmosiRNA2组的抑制效率明显强于SmosiRNA1及SmosiRNA-3组，提示转染72 h后，基因沉默的效果就已经显现，针对同一基因的不同部分的siRNA基因沉默效率不同，与报道相一致［9-10］;通过MTT检测发现SmosiRNA2组细胞活力低于其他各组，提示，在正常情况下，Smo因子的表达有利于软骨细胞的增长;并且，SmosiRNA2组的凋亡率明显高于其他组，提示Hh信号通路具有保护软骨细胞免遭凋亡的作用，下调Smo的表达可抑制软骨细胞的增殖促进软骨细胞的凋亡，与其他报道相一致［11-12］，转染结果表明 Smo对细胞有一定保护作用。在骨关节炎、氟性关节损伤等软骨疾病中，均能导致软骨细胞的凋亡［13-14］，Smo因子可保护软骨细胞免遭凋亡，能否通过上调Smo的表达而达到治疗疾病，尚有待进一步的实验研究。

［1］Raju GP.Arsenic:a potentially useful poison for Hedgehog-driven cancers［J］.J Clin Invest 2011，121:14-16.

［2］Lo WW，Wunder JS，Dickson BC，et al.Involvement and targeted intervention of dysregulated Hedgehog signaling in osteosarcoma［J］.Cancer，2014，120:537-547.

［3］Caparrós-Martín JA，Valencia M，Reytor E，et al.The ciliary Evc/Evc2 complex interacts with Smo and controls Hedgehog pathway activity in chondrocytes by regulating Sufu/Gli3 issociation and Gli3 trafficking in primary cilia［J］.Hum Mol Genet，2013，22:124-139.

［4］刘振峰，方锐，孟庆才.Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15:9323-9326.

［5］Chaudary N，Pintilie M，Hedley D，et al.Hedgehog pathway signaling in cervical carcinoma and outcome after chemoradiation ［J］.Cancer，2012，118:3105-3115.

［6］陈林松，史宏灿.胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析［J］.中国医药，2014，9:1522-1525.

［7］Kubo S，Kataoka M，Tateno C，et al.In vivo stable transduction of humanized liver tissue in chimeric mice via highcapacity adenovirus-lentivirus hybrid vector［J］.Hum Gene Ther，2010，21:40-50.

［8］林在俊，肖建如，罗剑，等.大鼠Smad6慢病毒干扰载体的构建与鉴定［J］.国际骨科学杂志，2011，32:386-388.

［9］Shah S，Friedman SH.Tolerance of RNA interference toward modifications of the 5'antisense phosphate of small interfering RNA［J］.Oligonucleotides，2007，17:35-43.

［10］史晨辉，王维山，李长俊，等.慢病毒介导uPA-siRNA重组表达载体的构建及促进兔软骨细胞增殖［J］.基础医学与临床，2014，34:603-609.

［11］Long F，Zhang XM，Karp S，et al.Genetic manipulation of hedgehog signaling in the endochondral skeleton reveals a direct role in the regulation of chondrocyte proliferation［J］.Development，2001，128:5099-5108.

［12］Zhao L，Yu Y，Deng C.Protein and mRNA expression of Shh，Smo and Gli1 and inhibition by cyclopamine in hepatocytes of rats with chronic fluorosis［J］.Toxicol Lett，2014，225:318-324.

［13］赵庆华，田纪伟，王雷.等.RNA干扰环氧合酶2对人腰椎退变终板软骨细胞生长增殖及凋亡的影响［J］.中华医学杂志，2011，91:1031-1035.

［14］Kim HA，Lee YJ，Seong SC，et al.Apoptotic chondrocyte death in human osteoarthritis［J］.heumatol，2000，7:455-462.

The effects of silencingSmogene on proliferation and apoptosis of rat primary chondrocyte

ZHU Zhi-jian，YU Yan-ni*，TAO Xin，DENG Chao-nan
（Dept.of Pathology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of silencing Smo gene on proliferation and apoptosis of rat primary chondrocyte in vitro.MethodsThe primary chondrocyte was obtained by mechanical-enzyme digestion and identified by Immunohistochemical cells（ColⅡ）.The animals were divided into control group，control siRNA group andSmosiRNA 1 ～ 3 group.The siRNA was transfected into chondrocytes by lentivirus vector.After 72 h，the cell viability was detected by MTT，Smo expression was detected by RT-PCR and Western blot，and the apoptosis of chondrocyte was assessed by flow cytometry.ResultsAll types of siRNA were transfected into primary chondrocyte by vectors，theSmosiRNA 1 ～ 3 may inhibit the expression ofSmomRNA and protein in chondrocytes，andSmosiRNA2 had the highest silencing rate（the expressions ofSmomRNA and protein were 0.19±0.03 and 0.39±0.07）.The cell viability inSmosiRNA2 group was lowest（77.38% ±7.19%），while the apoptosis rate ofSmosiRNA2 was highest（21.43% ±2.97%）.ConclusionsSilencingSmogene in primary chondrocytes may inhibit proliferation and promote apoptosis，Smomay have a protecting role from apoptosis of the chondrocyte.

primary chondrocytes;lentiviral vector;siRNA;apoptosis;proliferatio

R336

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.012

1001-6325（2015）09-1209-05

2015-03-27

2015-06-26

国家自然科学基金（81260419）;教育部博士点基金（博导类）（20125215110001）

*通信作者（corresponding author）:gyyxybl2010@163.com