柿叶总黄酮的制备及对肝损伤的保护作用

吕 超

（西安财经学院体育教学部，陕西西安710100）

柿叶总黄酮的制备及对肝损伤的保护作用

吕 超

（西安财经学院体育教学部，陕西西安710100）

以75%乙醇为溶剂提取、聚酰胺型大孔树脂柱初步纯化，制得柿叶总黄酮；采用四氯化碳（CCl4）诱使昆明种小鼠急性肝损伤模型，研究柿叶总黄酮对肝脏的保护作用。结果显示，柿叶总黄酮能够明显减轻CCl4诱使的肝损伤，降低血清中ALT、AST活性和肝组织MDA含量，提高肝组织中SOD和CAT活性，且存在明显的剂量效应关系。上述结果表明柿叶总黄酮对CCl4所致急性肝损伤具有强的保护作用，作用机制可能与其对脂质氧化的抑制作用及其抗氧化活性有关。

柿叶；总黄酮；肝保护作用；抗氧化活性

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的天然产物，由于其具有抑菌消炎、抗氧化［1－2］、预防心血管疾病［3］和抗肿瘤［4］等功效，近年来受到人们的极大关注。柿叶为柿树科（Ebenaceae）柿属（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f）的新鲜或干燥叶片，味苦、性寒、无毒，其主要有效成分是黄酮类化合物［5］。已有研究表明柿叶总黄酮具有多种药理和临床作用［3，6－8］，因而成为一类极具开发前景的天然植物药用资源。

近年来，随着环境污染日趋严重，人类对各类化学药物的使用大幅增加，与肝脏有关的疾病呈不断上升趋势。各种肝脏疾病，诸如A或B型肝炎、中毒性肝炎、肝囊肿、肝血管瘤、肝纤维化和肝硬化等已严重威胁人类健康，因而肝损伤保护研究成为天然药物研究［9－14］的热点之一。本研究以乙醇为溶剂提取，经聚酰胺柱初步纯化，制得柿叶总黄酮（PLTF），采用CCl4诱使小鼠急性肝损伤模型，研究柿叶总黄酮对化学性肝损伤的保护作用，以期为开发柿叶资源，进一步研究和开发肝脏保护性药物作一些探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小鼠（25±2g）48只，雌雄各半，购自西安交通大学医学院动物实验中心。分笼饲养，保持室温24～26℃，相对湿度60%～65%，自由进食和饮水。1.2 药品、试剂及仪器

柿叶购自陕西西安药材市场，清洗阴干后粉碎，用245μm粒径过筛，备用。四氯化碳（AR），购自天津市化学试剂一厂，用植物油配成0.2%的溶液供实验使用；联苯双酯滴丸，购自浙江万邦药业有限公司（批号081010，规格1.5mg／丸），按常规方法配制成质量浓度为10mg／mL联苯双酯水溶液供实验使用；丙二醛（MDA）、谷草转氨酶（ALT）、总超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙转氨酶（AST）试剂盒以及蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；聚酰胺粉（1 165～490μm粒径，上海润捷化工公司）；其他试剂均为国产分析纯。

724微型可见分光光度计（上海光学仪器厂）；旋转蒸发仪（RE－52A，上海亚荣生化仪器厂）；JJ－2组织捣碎匀浆机（金坛市开发区吉特实验仪器厂）；AnkeTGL－18C－C型离心机（德国BMGLABTECH公司）；快速恒温数显水箱（常州国华电器有限公司）。

1.3 柿叶黄酮的提取与初步纯化

参照文献［15］方法，称取柿叶粉10g，置于平底烧瓶，加入石油醚浸泡脱脂和除去叶绿素，然后加入75%乙醇100mL，水浴加热于70℃条件下提取90min，抽滤，定容；以芦丁为标准品，AlCl3显色法在433nm处测定吸光度，标准曲线法求得提取液中总黄酮含量，计算提取率。然后将提取液上聚酰胺型大孔树脂柱吸附，用蒸馏水淋洗至洗脱液无色后，用100mL浓度为70%的乙醇解吸，收集流出液，浓缩蒸干，105℃干燥，得初步纯化的柿叶总黄酮（PLTF）。

1.4 动物的分组与处理

取昆明种小鼠48只，随机分为6组：正常对照（NC）组、CCl4急性肝组织损伤模型（MC）组、柿叶总黄酮低、中、高（PLTF 1－3）组和阳性对照（PC）组，每组8只。NC和MC组每天用蒸馏水灌胃一次（10 mL／kg），PC组每天用联苯双酯水溶液灌胃一次（100mg／kg），PLTF 1－3组每天分别以50、100、300 mg／kg剂量灌胃一次。上述处理连续21d。第22天，除NC组用等剂量植物油灌胃外，其余各组用经超声波混匀的四氯化碳植物油溶液（0.2%）灌胃（10 mL／kg）。随后禁食24h，称重；从眼眶取血，脱臼致死，解剖取出肝脏。

1.5 血样和组织样品处理

“商”字的字形所描绘的，是殷人祭祀商星的形象，因为殷人通过观测商星的运行位置来判断用火活动的时间是否适宜。正是由于商星在殷人生活中的这种重要作用，使得殷人主祀商星，并用之以名其部族，继以名其国邑及朝代，而商星也在“分野”文化中，始终充当着对应殷人国土的星宿。

血样在室温下放置1h，37℃水浴5min，3 000 r／min离心10min，分离出血清，用于ALT和AST活性测定。

肝脏组织用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，用滤纸拭干，称重。精密称取一定量的肝组织，加入6倍肝重的冰冷生理盐水，用组织匀浆机捣碎、匀浆，将组织匀浆转移至离心管中，用3倍肝重的生理盐水冲洗组织匀浆机中的残留物。将已经制成的10%的匀浆在4℃、4 000r／min条件下离心5min，吸取上清液即为待测的肝组织匀浆，根据测试需求稀释到一定的浓度，用于测定肝脏组织CAT、SOD活性和MDA含量。

1.6 生化指标测定

取一定量的血清样，按试剂盒说明书操作，制作标准曲线，测定血清中ALT和AST的活力单位。取适当稀释的肝组织匀浆，根据试剂盒说明书操作测定，按公式计算肝组织匀浆中总蛋白和MDA含量以及SOD和CAT活性。

1.7 肝组织病理观察

取肝左叶小块（0.5cm×0.5cm×0.5cm），置4%甲醛缓冲溶液（pH 7.4）中脱水，按常规方法包埋、切片，以苏木精－伊红（HE）染色，光学显微镜观察肝组织病理改变。

1.8 统计方法

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理，单因素方差检验比较其差异性，P＜0.05为差异，P＜0.01为显著差异。

2 实验结果

2.1 柿叶总黄酮的提取与初步纯化

植物中黄酮类化合物有多种提取方法，文献［15］比较了热水提取法、乙酸乙酯提取法、甲醇和乙醇提取法，认为体积分数为75%的乙醇提取法对柿叶黄酮提取率较高，提取物容易浓缩和干燥，是一种较好的提取方法。本文亦采用75%乙醇为溶剂提取，柿叶粉碎后用245μm粒径过筛，液固比由1∶5提高至1∶10，柿叶总黄酮的提取率明显提高，达到13.8%。文献［16］研究结果表明，聚酰胺型大孔树脂对柿叶黄酮具有良好的吸附动力学特性，并有较好的解吸附率，较其他种类树脂更适宜提纯柿叶黄酮。本文采用聚酰胺树脂柱对柿叶黄酮进行初步纯化，纯化后柿叶提取物中总黄酮含量达72.5%。

2.2 柿叶黄酮对模型小鼠肝指数的影响

分别称取禁食24h后急性肝组织损伤模型小鼠体重和肝脏重量，计算肝指数L：

L＝m1（肝的重量）／m2（小鼠体重）×100%，其结果列于表1。

肝指数能反应动物的免疫功能和肝功能的状况，当肝细胞发炎肿大时肝的重量就会增加，肝指数就会明显地变大。从表1可见，MC组小鼠的肝指数比NC组有显著性（P＜0.01）增加，表明与正常组比较模型组小鼠肝细胞严重发炎，CCl4诱使小鼠急性肝损伤模型成功构建；PC组小鼠的肝指数与MC组有显著差异（P＜0.01），验证了联苯双酯具有防护急性四氯化碳肝损伤的作用；低剂量给药（50 mg／kg）PLTF 1组小鼠的肝指数虽有改善，但并不明显，随着柿叶黄酮给药浓度增加，肝指数逐渐恢复；当给药浓度达到300mg／kg（PLTF3）时，肝指数基本上恢复到正常水平（与NC组无显著性差异）。据此，可以初步看出，柿叶总黄酮能恢复改善由CCl4引起的免疫抑制作用，提高免疫低下小鼠的特异性细胞免疫功能，起到对CCl4诱导小鼠肝损伤的保护作用。

2.3 柿叶总黄酮对模型小鼠血清ALT和AST活性的影响

血清中ALT和AST活性测定结果亦列于表1。与NC组相比，MC组小鼠血清中ALT和AST活性显著（P＜0.01）升高；PC组虽与MC组相比也有显著性差异（P＜0.01），但与NC组相比亦有明显差异（P＜0.05），仍未达到正常水平；柿叶总黄酮给药组ALT和AST活性均有下降，且随着给药剂量增大，效果愈发明显；PLTF2组与MC组相比，ALT和AST活性水平已有明显差异（P＜0.05），而与PC组无明显差异；PLTF3组ALT和AST水平已经基本达到正常，且ALT活性明显低于PC组水平（P＜0.05）。结果表明，柿叶总黄酮能够使CCl4诱使急性肝损伤小鼠的血清ALT和AST水平升高得到有效抑制，其作用超过联苯双酯。

表1 柿叶总黄酮对CCl4诱使急性肝损伤小鼠肝指数、血清ALT和AST水平的影响Tab.1 Effect of PLTF on liver index，ALT and AST levels in serum of CCl4－treated rats（n＝8）

2.4 柿叶总黄酮对模型小鼠肝组织MDA含量和SOD、CAT活性的影响

模型小鼠肝组织MDA含量和SOD、CAT活性测定结果列于表2。从表2可见，MC组与NC组相比，肝组织MDA含量有显著升高（P＜0.01），说明小鼠肝脏由于脂质过氧化而造成了损伤；PC组与MC组相比MDA含量显著降低（P＜0.01），但与NC组相比MDA含量仍稍高；柿叶总黄酮给药组MDA含量均有下降，且明显地呈现剂量效应关系；PLTF2组与MC组相比，MDA含量已有明显差异（P＜0.05），已接近PC组水平；当给药浓度达到300mg／kg（PLTF3）时，MDA含量已经下降至正常水平。研究结果表明，柿叶总黄酮能降低CCl4诱导引发的小鼠肝组织中脂质过氧化物MDA含量，即能减轻或消除CCl4对肝细胞的损伤。

表2 柿叶总黄酮对CCl4诱使肝损伤小鼠肝组织MDA含量和SOD、CAT活性的影响Tab.2 Effect of PLTF on MDA，SOD and CAT of CCl4－treated rats（n＝8）

CCl4诱导小鼠肝脏的脂质过氧化损伤，使MC组肝组织中SOD和CAT活性显著地低于NC组和PC组（P＜0.01）；三个剂量的给药组（PLTF1－3）肝组织中SOD和CAT活性均有程度不同的增加，且存在明显的剂量效应关系；PLTF2虽未达到NC组和PC组水平，但与MC组相比，已有明显差异（P＜0.05）；PLTF3已达到或接近NC组水平，且SOD和CAT活性均高于PC组水平（P＜0.05）。这些结果表明，柿叶黄酮可以抑制CCl4所致肝脏SOD和CAT活性下降。

2.5 柿叶总黄酮对模型小鼠肝组织病理变化的影响

2.5.1 肉眼观察 仔细观察小鼠肝脏，正常对照组肝脏表面光滑、柔软，色泽稍暗；模型组肝脏肿大、表面粗糙、较脆，颜色灰暗；柿叶总黄酮给药组与模型组比较，表面光滑度和色泽均有不同程度改善，高剂量组外观和正常对照组小鼠肝脏已无明显差异。

2.5.2 光学显微镜观察 正常对照组（图1A）肝小叶呈多面体形，肝索排列整齐，肝细胞结构完整，核大居中，胞质丰富，未见坏死细胞和炎症细胞；而模型组（图1B）肝细胞碎屑样坏死，点状坏死及肝细胞浊肿水样变性，肝细胞损伤严重；柿叶总黄酮给药组上述症状明显减轻，低剂量组（图1D）效果稍差，中剂量组（图1E）、高剂量组（图1F），炎症细胞明显减少，正常肝细胞数目增多，与联苯双酯给药组（图1C）没有明显差别。

图1 CCl4诱使急性肝损伤小鼠肝组织学变化Fig.1 Histological results of liver tissues stained with HE under light microscope in CCl4－treated mice

3 讨论

四氯化碳（CCl4）肝损伤模型是经典的化学性肝损伤动物模型，CCl4引起肝损伤的机制系CCl4在肝微粒体细胞色素P－450酶激活下产生活性三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，这些自由基可与肝细胞内大分子发生共价结合［9］，也可攻击肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，损伤肝细胞膜的结构和功能，使膜通透性升高，导致细胞肿胀坏死［1011］。由于肝脏内源物可通过受损细胞膜渗漏进入循环系统，临床上一般认为肝脏受损伤的结果和标志是血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶等肝脏胞内酶活性上升［12］。研究结果显示，柿叶总黄酮能有效地抑制四氯化碳所致小鼠血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性上升，这可能与柿叶黄酮能有效地清除一些损害细胞的自由基有关。

肝脏中MDA含量及SOD、CAT活性高低可以反映肝脏受自由基和脂质过氧化损伤的程度。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量高低反映了膜脂质过氧化程度的强弱和细胞损伤的程度［10，12］；SOD是体内清除自由基的关键酶，可以抑制自由基启动的脂质过氧化反应［10，13］；CAT参与生命过程中的各种代谢反应，是肝脏组织细胞内最重要的能清除代谢过程中各种自由基的抗氧化物质之一［14］。研究结果显示，柿叶总黄酮能明显降低CCl4致肝损伤肝组织中MDA的含量，显著提高SOD和CAT活性。

张艳和杨建雄［17］已经报道了柿叶醇提物乙酸乙酯萃取制剂对四氯化碳急性肝损伤的保护作用，但认为以100mg／kg剂量较好，200mg／kg剂量对肝细胞氧化损伤的保护作用减弱。而本研究结果表明，随着柿叶总黄酮给药剂量增大，肝损伤的保护效果愈发明显。这可能与给药的纯度有关，较高剂量的酚酸类物质对肝细胞有一定损害作用［17］。在文献［17］的报道中，效果最好的100mg／kg剂量，其所有测定的生化指标均远未达到正常水平；本研究结果则存在明显的剂量效应关系，当给药剂量达到300mg／kg时，所有生化指标均与正常组无显著性差异。显然，300mg／kg应为给药的最高剂量。

4 结论

柿叶总黄酮能够拮抗CCl4诱发的肝细胞自由基和脂质过氧化损伤，对四氯化碳诱使的小鼠肝损伤具有明显的保护作用，其作用力与联苯双酯接近。因此，柿叶总黄酮具有很好的开发利用价值和临床应用前景。本文研究为进一步研究和开发柿叶总黄酮药物提供了参考依据。

［1］Li C H，Du H，Wang L S，et al.Flavonoid composition and antioxidant activity of tree peony（Paeonia Section Moutan）yellow flowers［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57：8496－8503.

［2］Zhang L，Ravipati A S，Koyyalamudi S R，et al.Antioxidant and anti－inflammatory activities of selected medicinal plants containing phenolic and flavonoid compounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：12361－12367.

［3］陈丽，梁宇红，马新博，等.柿叶总黄酮对高脂血症大鼠脂肪肝和脂蛋白代谢相关酶的影响［J］.中国现代应用药学，2011，28（7）：606－611.

［4］孙权，徐俊萍，许惠仙，等.大豆异黄酮抗肿瘤作用的研究［J］.食品科技，2009（8）：60－62.

［5］陈光.柿叶化学成分及生物活性的研究［D］.沈阳：沈阳药科大学药学院，2003.

［6］Sun L，Zhang J，Lu X，et al.Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon（Diospyros kaki L.）leaves［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49：2689－2696.

［7］Bei W，Peng W，Ma Y，et al.Flavonoids from the leaves of Diospyros kaki reduce hydrogen peroxide－induced injury of NG108－15cells［J］.Life Science，2006，76：1975－1988.

［8］周鑫堂，王丽莉，韩璐，等.柿叶化学成分和药理作用研究进展［J］.中草药，2014，45（21）：3195－3202.

［9］肖增平，吉爱国，宋淑亮，等.绞股蓝多糖对小鼠四氯化碳肝损伤的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2008，29（3）：186－188.

［10］李素婷，杨鹤酶，石艳华，等.黄芩茎叶总黄酮对CCl4小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.承德医学院学报，2003，20（4）：292－292.

［11］陈强.薰衣草醇提物对小鼠急性肝损伤保护作用的研究［J］.中国城乡企业卫生，2010（5）：102－104.

［12］侯玉如，吴京燕，江海涛，等.柳松菇对急性四氯化碳肝损伤的防护作用［J］.中国食用菌，2005，24（2）：50－53.

［13］Kumaravelu P，Dakshinamoorthy D P，Subramaniam S，et al.Effect of eugenol on drug－metabolizing enzymes of carbon tetrachloride－intoxicated rat liver［J］. Biochemical Pharmacology，2006，49：1703－1707.

［14］Orhan I E，Sener B，Musharraf S G.Antioxidant and hepatoprotective activity appraisal of four selected Fumaria species and their total phenol and flavonoid quantities［J］.Experimental and Toxicologic Pathology，2012，64：205－209.

［15］宋常春，鲍庆胜.柿叶黄酮类化合物提取方法和抗氧化性的研究［J］.食品与发酵工业，2004，30（9）：117－119.

［16］贝伟剑，彭文烈，罗杰.柿叶黄酮的大孔吸附树脂分离提纯富集［J］.中成药，2005，27（3）：257－261.

［17］张艳，杨建雄.柿叶提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用的研究［J］.陕西师范大学学报：自然科学版，2013，41（1）：65－68.

〔责任编辑 王 勇〕

Study on the protective effect of total flavonoids in persimmon leaves against carbon tetrachloride－induced acute liver injury

LÜChao
（Department of Physical Education，Xi′an University of Finance and Economics，Xi′an 710100，Shaanxi，China）

The flavonoids were extracted from dried persimmon（Diospyros kaki L.f）leaves with 75%ethanol and preliminarily purified with macroporous resin.The protective effect of persimmon leaves total flavonoids（PLTF）against carbon tetrachloride－induced（CCl4）on acute liver injury in rats of was investigated.The results showed that PLTF obviously reduced the liver damage，significantly decreased the AST and ALT levels in serum，remarkably lowered the liver indexes and MDA level，and elevated the SOD and CAT levels in hepatic tissues.These results indicate that PLTF has a protective effect against CCl4－induced acute hepatotoxicity in rats，and the hepatoprotective effects may be due to both the inhibition of lipid peroxidation and the increase of antioxidant activity.

persimmon leaves；total flavonoids；hepatoprotective effect；antioxidant activity

R284.2

：A

1672－4291（2015）05－0067－04

10.15983／j.cnki.jsnu.2015.05.354

2015－03－06

国家自然科学基金（20875060）

吕超，男，讲师，陕西师范大学化学化工学院访问学者，研究方向为运动生物化学与运动营养学。E－mail：Jardon－800＠163.com