超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺研究

◎吉仙枝

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡472000）

超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺研究

◎吉仙枝

（三门峡职业技术学院食品园林学院，河南三门峡472000）

以野生山药为原材料，采用超声波辅助提取α淀粉酶浸提的方法分别研究了超声功率、超声时间、超声温度和α淀粉酶浸提阶段的α淀粉酶用量对野生山药多糖提取效果的影响；并通过正交实验得出超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖的最佳工艺参数。结果表明：各因素对野生山药多糖得率的影响次序为：超声功率>超声时间>超声温度>α淀粉酶用量。最佳参数组合是：固液比1g：50mL，前期超声提取阶段功率1000W，时间选定60min,温度70℃；后期α淀粉酶浸提阶段α淀粉酶用量0.2%，酶促反应体系温度60℃，pH为6.0，浸提时间为30min。按最佳工艺参数提取，野生山药多糖得率为11.5%。

野生山药；多糖；超声波辅助提取；α淀粉酶

山药，即薯蓣，别名怀山药、淮山药、土薯、山薯、山芋、玉延。多年生蔓型草本植物，根茎圆柱形，直生，长可达1米。根茎含淀粉和蛋白质，具有营养滋补、诱生搅扰素、调度内排泄、补气通脉、增强机体免疫力、镇咳祛痰、平喘等作用，因此，山药是食药两用植物。中国主产于河南省北部（焦作境内，含博爱、沁阳、武陟、温县等县），山东（单县、苍山、寿光、兖州、嘉祥、泰安、桓台、邹平等）、河北、山西及中南、西南等地区也有栽培。

山药的栽培历史悠久，普通山药和田薯是主要的栽培品种。普通山药中以古代怀庆府（位于河南省焦作境内，地域涵盖沁阳、武陟、博爱、温县等）出产的最为著名，习称“怀山药”，外部特征为块茎较其他山药小，营养丰富。药理学研究认为，怀山药不仅营养滋补，它所富含的山药多糖能诱生干扰素、活跃机体的免疫系统功能、调整新陈代谢、改善循环系统功能，其对于慢性气管炎、冠心病、心绞痛等均有辅助治疗作用。目前，河南焦作的“铁棍山药”、山东省菏泽的“陈集山药”、湖北武穴的“佛手山药”、江西瑞昌市南阳乡的山药已申请了国家地理标志保护产品[1]。本文采用超声波协同α淀粉酶辅助提取野生山药多糖，选用苯酚-硫酸法测定野生山药多糖含量，选择不同超声频率、超声温度、超声时间、α淀粉酶用量等条件展开研究。并且在前人研究的基础上[2][3][4]，将超声波辅助提取和α淀粉酶浸提分开进行，使超声功率的选择不再受酶活性的限制，很好地提高了野生山药多糖的提取率，为进一步开发利用野生山药资源提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

1.1.1 主要仪器

DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）

722N型可见分光光度计(上海天普分析仪器有限公司)

HH-S11-8-S电热恒温水浴锅（金坛市华特实验仪器有限公司）

FA2204B型电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）

高速组织捣碎机（上海乔跃电子有限公司）

1.1.2 试剂

硫酸、苯酚、无水氯化钙和葡萄糖均为分析纯试剂

α淀粉酶（郑州康源化工产品有限公司）

本实验用水均为蒸馏水

1.1.3 材料

山药（野生，采挖于河南省修武县）

1.2 葡萄糖标准液的配制

用FA2204B型电子天平称取分析纯干燥恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，配得1mg/ml的葡萄糖储备液，再用移液管准确量取10.00ml储备液后定容至100ml，即得到0.1mg/ml的葡萄糖标准液。

1.3 苯酚溶液的配制

取100g无色针状的苯酚晶体，90℃水浴中保温至融化，加入0.05gNaOH进行蒸馏提纯，取178-182℃的馏出液9.375g加入150ml蒸馏水中，制得26.25%的苯酚溶液，棕色瓶中储存备用。

2 试验方法

2.1 山药的预处理

取适量新鲜山药，洗净，去皮，切薄片，于电热恒温鼓鼓风干燥箱中105℃充分烘干并用研钵粉碎。

2.2 山药多糖的提取

操作流程如下图所示。

准确称取5份已粉碎的山药样品2g，置于5个已加入100ml蒸馏水的锥形瓶中，选择不同超声波功率、超声温度、超声时间和α淀粉酶用量来分别进行单因素实验，离心分离后取出浸提液进行水溶性糖含量测定，进行正交分析确定超声波功率、超声温度、超声时间和α淀粉酶用量的最佳组合。

超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺流程图

2.3 山药多糖含量的测定方法

采用苯酚-硫酸法。

2.3.1 绘制标准曲线[5]

准确移取0.1mg/ml的葡萄糖标准液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml，分别放置于10ml的比色管中，分别补加蒸馏水至2ml，另取一支比色管直接加蒸馏水至2ml作为空白对照。在以上比色管中均加入6.25%的苯酚溶液1.0ml，摇匀后各加浓硫酸5.0ml，再次摇匀，冷却至室温，490nm可见光处测量吸光度。根据测量数据绘制标准曲线并计算，得出回归方程为：A=10.51C（mg/ml）+0.0123,相关系数r=0.9991。

2.3.2 测定野生山药多糖含量

将2.2操作中，按照不同超声波功率、超声温度、超声时间和α淀粉酶用量等参数条件进行的野生山药提取液，准确移取0.1ml，分别置入10ml的比色管中，补加蒸馏水至2ml，测定其吸光度，并计算出不同加热温度和时间水溶性糖的含量[6-7]。

3 结果与讨论

3.1 超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺的单因素实验

3.1.1 超声辅助提取时超声功率的选择

按照2.2操作的方法，因为这里采用了先超声提取再酶解的方式，不用考虑酶的耐受温度，故选定超声提取温度70℃，提取时间为50min。之后的α淀粉酶辅助提取阶段，α淀粉酶（2000u/g）添加量按照厂家提供的一般使用量加入，同时加入0.2%无水氯化钙（按原料重量计算），选用该酶的最适反应温度和最适反应pH，进行浸提，使用沸水浴灭活酶，离心分离后取出浸提液进行野生山药多糖含量测定。测定结果如表1。

由表1可知，超声功率在700W-1100W之间时，由于超声波作用于细胞后，野生山药多糖溶出率与超声功率呈现正相关，随着超声功率的增大，多糖得率逐渐提高。但在选择超声功率时，需要考虑到大功率的超声波会造成部分多糖的分解等一些负面影响[8]，结合数据分析，超声功率大于900W后，对野生山药多糖得率的影响没有之前明显。

3.1.2 超声辅助提取温度的选择

按照2.2操作的方法，选定超声功率为900W，提取时间为50min。以上几个条件不变的情况下，考虑到淀粉的糊化和老化，超声辅助提取温度不宜超过70℃。之后的α淀粉酶辅助提取阶段操作与3.1.1同。超声温度对测定结果的影响如表2。

由表2分析可知，由于植物多糖难溶于冷水，在所选定的温度范围内，开始时随温度升高，测得的野生山药多糖含量逐步升高，但是温度升高也伴随着淀粉的糊化程度增加，当温度大于60℃后，测得的野生山药多糖含量增加幅度降低，得率增加值减缓。

表1 超声功率对提取效果的影响

表2 超声温度对提取效果的影响

3.1.3 超声辅助提取时间的选择

按照2.2操作的方法，选定超声功率为900W，超声温度为70℃。之后的α淀粉酶辅助提取阶段操作与3.1.1同。以上几个条件不变的情况下，超声辅助提取时间对野生山药多糖含量测定结果的影响如表3。

由表3可知，随着超声辅助提取时间的延长，所测得野生山药多糖含量逐步升高，当超声辅助提取时间达到50min后，野生山药多糖得率的增高趋势不明显，50min至90min的区段内，野生山药多糖得率基本处于一个稳定的数值，不再增加。

3.1.4 α淀粉酶用量的选择

按照2.2操作的方法，超声辅助提取阶段选定为超声功率900W，提取时间为50min，提取温度70℃。结束后，待溶液温度降至60℃（α淀粉酶的最适反应温度），将溶液pH调至6.0（所用的α淀粉酶的最适pH由厂家提供），进行时间为30min的α淀粉酶辅助提取。在其他条件不变的情况下，加入不同量的α淀粉酶（2000u/g）和0.2%无水氯化钙（按原料重量计算）进行浸提，按照2.2操作的方法，进行野生山药多糖含量测定，确定超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺的最佳加酶量。α淀粉酶用量对测定结果的影响如表4。

根据酶促反应的特点分析，在反应体系中其他成分不变的情况下，酶促反应的特定底物与酶的接触机会随着酶浓度上升而增加，伴随这个过程野生山药多糖在被分离出来。但是，当酶浓度升高至所有的底物分子都能与酶分子结合后，酶分子就处于过饱和状态，底物被水解的速度不再与酶分子的增加呈现正相关。由表4可知，α淀粉酶量低于4mg时，野生山药多糖得率随α淀粉酶用量的增加而增大。当加酶量高于4mg后，多糖得率逐渐减小。

3.2 超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺超声辅助提取阶段实验条件优化

在单因素实验的基础上，选取超声时间、超声温度、超声功率和α淀粉酶用量四个因素，以野生山药多糖得率为指标，设计4因素3水平的正交实验见表5，对超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺参数进行优化。

由表5的极差分析结果可知，实验所选的4个因素对多糖得率的影响次序是：超声功率>超声时间>超声温度>α淀粉酶用量。超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺的最佳参数组合为：超声功率1000W,超声提取时间60min,超声提取温度70℃,α淀粉酶用量5mg。综合考虑单因素实验的数据，最终选择α淀粉酶用量4mg为最佳工艺参数。按最佳工艺参数重复提取，野生山药多糖得率为11.5%。

表3 超声时间对提取效果的影响

表4 α淀粉酶用量对提取效果的影响

表5 超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺参数优化正交实验设计

4 结论

本研究表明，超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺的最佳参数组合为：前期超声提取阶段的超声功率1000W，超声提取时间选定60min,超声提取温度70℃；后期α淀粉酶浸提阶段α淀粉酶用量4mg，酶促反应体系温度60℃，pH为6.0，浸提时间为30min。这一工艺设计将超声波和α淀粉酶两个辅助因素进行阶段性的分离，回避了超声功率对酶活性的不良影响[9]，更好地发挥了两者在野生山药多糖提取过程中的有利作用，较好地提高了野生山药多糖的提取率。可见，超声波协同α淀粉酶提取野生山药多糖工艺对更好地开发野生山药资源，尤其对山药多糖生产具有一定的应用价值。

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（责任编辑 卞建宁）

TS218

A

1671-9123（2015）01-0140-05

2015-01-17

吉仙枝（1979-），女，河南义马人，三门峡职业技术学院食品园林学院讲师。