基于毒性效应的非目标化学品鉴别技术进展

邓东阳，于红霞，张效伟，史薇

南京大学环境学院 污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京 210023

基于毒性效应的非目标化学品鉴别技术进展

邓东阳，于红霞，张效伟，史薇*

南京大学环境学院 污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京 210023

现代社会大量化学品的生产与广泛使用造成了地表水、地下水、沉积物、土壤等环境受到污染，并对人体健康和生态系统构成威胁。基于毒性效应的关键致毒物质鉴别技术(effect directed analysis, EDA)已经在水体、沉积物的致毒物筛选方面得到了一定的应用。但是由于污染物组成复杂、范围广、基质干扰高、同分异构体广泛存在、人工合成标样缺少等问题，非目标致毒化合物的鉴别成为了EDA的瓶颈技术。逐渐发展的色谱与质谱技术、数据库指标在化合物筛选识别中发挥了重要作用。本文综述了基于高分辨质谱，数据库搜索，色谱保留特征，模型构建来筛选识别化合物的方法，总结了近年来化合物筛选识别方法在环境新型污染物及药物筛选等方面的应用并分析了化合物筛选识别所存在的问题与应用前景。这些方法可以提高非目标化合物筛选的准确性和通量，减少样品复杂性和基质干扰带来的负面影响，从而有利于未知化合物的确定。

非目标毒物鉴别；高分辨率质谱；数据库；色谱保留特征；模拟

现代社会化学品大规模生产与使用，在给人们带来福利的同时大量化学品及其中间产物或副产物进入环境，造成地表水、地下水、沉积物、土壤、生物组织甚至食物的污染[1]。这些污染物对人体健康和生态系统构成威胁，常规的化学监测可以定量反应受污染环境介质中各种优控污染物的浓度，但无从体现复合生态环境受各种化学品影响的整体风险水平，因为环境介质中有大量的未知化学品以及这些化学品的中间产物/代谢产物等，这些未知物没有被列入日常监测范围也无法进行进一步的风险评估。而生物测试手段虽然能反应复合生态环境受各种化学品影响的整体风险水平，但不能获取样品中主要致毒化学品的名称和种类等信息，也无法服务于后期管理需求。因此如何从受污染的样品中识别出主要致毒物是一项具有重要意义的工作。

将化学分析与毒性测试相结合，用于识别环境中主要致毒化学品的技术称为基于毒性测试的污染物鉴别技术(effect directed analysis, EDA)。其流程如图1所示，主要包括4个部分：毒性测试、分级分离、致毒物质的筛选与识别、毒性确认[2]。毒性测试可以获得样品的毒性和潜在风险，依据研究目的选择合适的毒性效应，当前常见的毒性效应包括：致突变性、内分泌干扰效应、芳香烃受体效应和水生生物毒性(发光细菌、绿藻、无脊椎动物)等[3]。分级分离的目的是通过去除无毒成分来降低污染物的复杂性从而有利于致毒物的筛选与识别。分离是基于分析物的物理化学性质包括极性、疏水性、分子大小、平面性和特定官能团的存在等来实现的[4]。当前常用的分级分离方法包括：固相萃取、反相液相色谱、正相液相色谱、体积排阻色谱、亲水作用色谱、亲和色谱和薄层色谱等分离方法。在分级分离的基础上进行毒性测试，进而针对主要致毒组分进行致毒化合物的筛选与识别。化合物的筛选与识别是基于毒性测试的污染物鉴别技术最关键和亟待进一步解决的问题。通过质谱对待测污染物进行全扫描得到的图谱与仪器自带的标准谱库或者在线数据库进行比对获得可疑物质清单，配合核磁共振、紫外吸收光谱、红外吸收光谱等化合物鉴定手段来实现化合物的筛选与识别[5]。近年来高分辨率质谱由于其灵敏度高，质量误差小，分辨率高等特点，使其在化合物筛选中具有明显优势。毒性确认的目的是确定化合物在总效应中的贡献率。目前毒性确认方法有：基于剂量效应关系的定量验证、具有类似作用模式的浓度加和法与独立作用模式产生的加和效应、可疑物质添加法的效应验证和定量结构效应关系预测毒性等[6]。

近几年在高通量毒性测试与高分辨化学分析方法建立的前提下，基于毒性效应的有机毒物鉴别技术得到快速发展。Shi和Hu等学者[7-10]对水源水、地下水、自来水厂出水、自来水、煮沸的自来水进行了甲状腺激素干扰活性、雄激素活性和雌激素活性测试，通过活化的佛罗里硅土玻璃填充柱来实现分离，利用气相色谱质谱联用仪、液相色谱和气相色谱来实现定量检测，最终识别出其中的关键致毒物为邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二异壬酯、有机氯农药、有机磷农药、壬基酚和辛基酚等。Weiss等学者[11]对欧洲河流沉积物进行了雄激素活性测试，基于凝胶渗透色谱净化，通过反相液相色谱、正相液相色谱实现分离，利用气相色谱质谱联用仪来实现定量，最终识别出其中的关键致毒物为多环芳烃、壬基酚、邻苯二甲酸二丁酯等。Thomas等学者[12]对北海岸石油生产平台排放的废水进行了雄激素和雌激素活性测试，通过正相色谱实现分离，利用高分辨率飞行时间质谱筛选活性组分的致毒物，最终识别出其中的关键致毒物为环烷酸、烷基酚、多环芳烃等。

化合物筛选识别已经在水体、沉积物等环境样品中得到成功应用，并且发现一些新型化合物或者之前未被关注的化合物。准确可靠的化合物筛选识别方法将有助于找到致毒物质和污染源，是化学品环境风险评价的前提，可以为环境管理提供依据。目前在未知污染物识别方面存在污染物成分复杂、范围广、基质干扰高、浓度低、同分异构体广泛存在等问题，因此需要进一步建立和优化非目标污染物高通量筛选和识别方法[13]。本文综述了近年来非目标化合物筛选的技术与方法，为新型化合物的发现提供借鉴。

图1 基于毒性测试的污染物鉴别技术流程[1]Fig. 1 Procedure of effect directed analysis (EDA) [1]

非目标污染物筛选识别有4种方法：(1)应用数据库筛选；(2)基于高分辨率质谱筛选；(3)基于化合物的色谱保留特征筛选；(4)基于合适的模型筛选。在整个化合物筛选识别过程中贯穿始终的是数据库的应用。非目标污染物筛选识别的流程如图2所示。

1 应用数据库筛选化合物

数据库搜索的目的是获得与库分子式匹配的化合物的准确结构或者接近匹配的化合物的部分结构信息，是基于高分辨率质谱、色谱保留特征和合适模型筛选化合物的技术基础。因此由经验获得的图谱收集在一起形成的数据库是化合物筛选的必备条件。数据库包含化学数据库和质谱数据库。化学数据库储存的是化合物的信息，包括分子式、结构式、物理化学性质等，是化学信息的综合系统。质谱数据库储存的是基于仪器定性或定量的化合物的质谱谱图，可以通过碎片峰数据来检索相似谱图，但谱图的数量有限。化学数据库是质谱数据库的基础，质谱数据库是化学数据库的深化。基于准确质量数通过化学数据库匹配搜索可以获得化合物分子式[14]。Booij等[15]筛选海洋藻类光合作用抑制剂时利用免费的ChemSpider数据库与质谱数据匹配获得化合物的分子式清单。Hernández等[16]筛选水体有机微污染物时利用商业的NIST数据库与质谱数据匹配获得化合物的分子式和离子碎片等信息。数据库搜索是后续筛选的基础。一些常见的化学数据库有ChemSpider、PubChem和NIST Chemistry WebBook等。质谱数据库的目的是将获得的图谱与数据库中化合物图谱进行匹配，通过匹配度高低来减少候选化合物的数量从而有利于化合物的筛选[17]。一些常见的质谱库有MassBank、NIST MS/MS Library和ReSpect for Phytochemicals等。下面我们将对一些常见的数据库及其特点进行总结。

图2 非目标污染物筛选识别的流程Fig. 2 Procedure of screening and identification of nontarget toxicants

1.1 化学数据库

(1)ChemSpider(http://cssp.chemspider.com)是一个免费在线的数据库，该数据库提供接近2 500万个化合物信息。ChemSpider提供每个化合物的各种信息：分子式、结构式、质量数、物化性质(熔点、沸点、蒸汽压、折光指数、分配系数LogP、溶解性、ACD/Labs预测的物化性质、EPISuite预测的物化性质)、气相色谱保留指数和光谱数据(红外光谱、核磁共振波谱)等[18]。这些数据都可用于化合物的筛选，而且这些数据不断更新。

(2)PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)即有机小分子生物活性数据库，包括PubChem Substance、PubChem Compound、PubChem BioAssay 3个子数据库。PubChem Substance包含由用户上传的样品原始信息并且这些信息与生物活性信息相链接，PubChem Compound包含PubChem Substance目录中独特的化学结构信息，PubChem BioAssay包含各种生物活性测试结果[19]。比较常用的是PubChem Compound数据库，该数据库提供化合物的分子式、结构式、物化性质(沸点、熔点、密度、解离常数、燃烧热、正辛醇-水分配系数、溶解性、蒸汽压、氢键供体、氢键受体、拓扑极地表面积、互变异构体数、旋转键数)等信息[20]。该数据库更适合生物小分子化合物的筛选。

(3)NIST Chemistry WebBook(http://webbook.nist.gov)包含由美国国家标准与技术研究院和其他资源提供的化合物物化性质方面的数据。该数据库提供有机和无机化合物的热化学数据(生成焓、燃烧焓、相变焓、热容量、熵、相变温度、蒸汽压)、反应热化学数据(反应焓、反应自由能)、离子能量数据(电离能、表面能、电子亲和能、质子亲和能、气体碱性、离子团结合能)、流体热物理数据(密度、比容、恒压热容、恒容热容、热导率、表面张力)和光谱数据等[21]。该数据库定期更新，而且所有数据来源于同行审议的文献和原始数据。

1.2 质谱数据库

(1)MassBank(http://www.massbank.jp)是第一个关于生命科学小分子化合物(<3 000Da)公开的质谱数据库，该数据库提供各种仪器类型的质谱图，包括气相色谱-电子电离-四级杆/飞行时间质谱GC-EI-QTOF，液相色谱-电喷雾离子化-四级杆/飞行时间质谱LC-ESI-QTOF，液相色谱-大气压化学电离-四级杆/飞行时间质谱LC-APCI-QTOF，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱MALDI-TOF等。不同实验条件下的电喷雾电离多级质谱图具有差异性，利用2张质谱图的相似度得分值来识别化合物，可以显著提高化合物识别的准确度[22]。MassBank也提供每个化合物的合并图谱数据，合并图谱是将同一化合物在不同碰撞诱导解离条件下的电喷雾电离多级质谱数据合并分析得到的，数据合并显著提高了化合物识别的精确度[23]。因此MassBank对化合物的识别起重要作用。

(2)NIST Mass Spectral Library(http://www.nist.gov/srd/nist1a.cfm)是一个由美国国家标准与技术研究院经验丰富的质谱学工作者创立的世界上使用最广泛的综合数据库，含有电子电离质谱库和多级质谱库。该数据库的化合物主要包括用气相色谱质谱联用仪测定的药物、代谢物、杀虫剂、杀菌剂和土壤、水、大气样品中常见的有机物等[24]。电子电离质谱库是一个标准的质谱库，一致的电离能量造成相同并且碎片丰富的质谱图，同时增加了比对的可靠性，但是母离子丰度很低或者没有。多级质谱库是利用离子阱和碰撞池等装置在电喷雾离子化方式下生成的图谱组成的数据库。该数据库是化合物筛选识别中应用最广泛的数据库。

(3)ReSpect for Phytochemicals(http://spectra.psc.riken.jp)是由天然产物工作者和质谱分析工作者创立的用于研究植物代谢组学的数据库，它由文献收集和内部自带的多级质谱数据组成[25]。搜索方式包括碎片搜索、光谱搜索和关键词搜索。最常用的搜索方式是碎片搜索，在碎片搜索中通过选择离子化方式、质荷比和质荷比偏差等来完成搜索。搜索记录中包含碎片相关法则，可以通过设定相对强度进行排序。碎片相关法则是用于模拟识别数据库中各种变量之间关系的一种算法。该数据库可用于补充植物学相关研究中的化合物鉴别工作。

2 基于高分辨率质谱筛选化合物

2.1 质谱数据的处理

质谱是化合物分析的一种标准方法，它可用于分析化学品的元素组成，也可通过质谱碎片获得化合物的部分结构信息[26]。高分辨率质谱可以减少由精确质量数获得的可疑分子式数量，从而对化合物的筛选起到关键作用。质谱数据的处理包括以下方面：(1)扣除背景噪音，现在大多数质谱软件工具含有内置算法来扣除背景噪音，从而获得相对无干扰的质谱图。Winding等[27]提出的CODA算法已经用于处理液相色谱-电喷雾离子化质谱获得的数据，类似的算法也在药物发现方面得到了应用[28]。(2)检测加和离子，不同的加和离子可形成不同的碎片裂解途径[29]。当前的离子化技术有电子撞击电离、化学电离、电喷雾电离、大气压化学电离、大气压光化学电离、基质附助激光解吸电离等。溶剂和缓冲体系、离解常数pKa、酸碱度pH、物质的质子供体和给体特性和气相酸度等因素都会影响加合物的形成[30-31]。软件工具如CAMERA和IntelliXtract有助于自动检测加和离子[32]。目前还没有关于某一化合物在特定离子化模式下预测加和物可能性的软件。(3)确定带电荷态，电荷态在蛋白质组学中起着重要作用，许多有机小分子通常是单电荷态。某些分子如心磷脂质类可形成单电荷态或多电荷态。多电荷态的形成受缓冲液浓度、分析物浓度、有机改性剂和流速的影响[33]。大多数质谱软件可以确定带电荷态，公开的软件如Decon2LS可以自动确定带电荷态[34]。(4)准确质量数测定，不同类型的高分辨率仪器质量数误差是不一样的。高分辨率仪器中傅立叶变换质谱的质量误差最小，其次是轨道阱质谱，飞行时间质谱的质量误差最大。(5)同位素丰度测量及同位素模式计算，不同元素的同位素模式是不同的。元素(F, Na, P, I)属于单一同位素，元素(H, C, N, O, S, Cl, Br)属于多同位素[35]。加速器质谱法是测定同位素丰度的最敏感和准确的方法，该方法可用于年龄测定和食品监测[36-37]。基于多项式或傅立叶转化获得的算法已经用于精细结构同位素的计算，包括IsoDalton、MWTWIN、Mercury、IsotopeCalculator、IsoPro、emass/qmass、libmercury++、ISOMABS和Decon2Ls等[38-39]。(6)元素组成测定，七条黄金法则是元素组成计算的一套启发式法则。免费公开的软件SIRIUS具有良好的图形界面，利用该软件可以获得峰强度、分子式中杂原子数和中性丢失等信息[40]。(7)基于质谱碎片计算分子式，多级离子碎片信息已经在元素组成测定中得到了应用。布鲁克发明了SmartFormula 3D算法，利用递归算法从低质量碎片中排除不符合的分子式。Sirius Starburst是一款将质谱碎片和元素比信息结合到元素组成测定的免费公开软件[41]。(8)质谱库搜索，电子撞击离子化质谱的搜索算法是最早开发的，这些算法包括INCOS算法、概率匹配和点积算法[42-43]。电子撞击离子化图谱在不同仪器上是可以重现的，但该质谱库是商业性质的。免费公开的质谱库有Massbank和ReSpect for Phytochemicals等。(9)质谱解析，通过质谱解析可以验证碎片的合理性，它是随着电子撞击离子化质谱发展而发展的。Turecek和McLafferty等[44]写了一本质谱解析的红皮书，该书介绍了碎片裂解途径和反应的详细说明，包括重排反应、均裂或异裂的化学键裂解反应、氢重排、电子转移、共振反应和芳烃稳定化等。

2.2 化合物筛选识别策略

不同高分辨率质谱仪器用来筛选识别化合物的方法是不同的。化合物筛选识别在环境领域得到了成功的应用，具体的例子如表1。

表1 高分辨率质谱筛选化合物方法实例Table 1 Example of identification of chemicals by high resolution mass spectrum

续表1

微型飞行时间质谱(布鲁克道尔顿)microTOFIImassspec-trometer(BrukerDalton-ics)3.TheeXposealgorithmwasusedtocalculateretentiontimeandmassposition,aswellasintensityratiosofpeaks.Themasserrorwassetat0.01m/zandthetoleranceforretentiontimewassetat0.1min.Apeakdetectedwithaspecificm/zintheactivefractionneededtoexceed5timestheabundanceofapeakdetectedinthenon-activefraction,eachpeakwithS/N>34.利用软件DataAnalysis的SmartFormula工具生成可能的分子式。参数设置为:元素P0-9,S0-10,F0-16,Cl0-16,Br0-4,Si0-8,C,H,O,N自动匹配;质量数最大偏差为5ppm;质谱峰理论和实际同位素分布模式匹配度最大值为50;相对强度为20%4.ThepossiblemolecularformulawascalculatedusingtheSmartFormu-latoolwithintheDataAnalysissoftware.Parameterssetting:P0-9,S0-10,F0-16,Cl0-16,Br0-4,Si0-8,C,H,NandOwereau-tomatically;amaximumdeviationofmasswassetat5ppm;themaxi-mumvaluefortheagreementbetweenthetheoreticalandmeasurediso-topicpatternofthemasspeakwassetat50;therelativeintensitywassetat20%5.利用软件DataAnalysis的CompoundCrawler工具对生成的分子式进行数据库NIST、ChemSpider和METLIN搜索,设定超过50篇参考文献引用的化合物为初步确定的化合物5.Alibrarysearchofthemolecularformulawasperformedbyusingthe-CompoundCrawlertoolintheDataAnalysissoftware,whichconnectstoseveraldatabasesincludingChemSpider,NISTandMETLIN.6.化学验证:对初步确定的化合物购买标样来评价其色谱和质谱行为,标样和样品观察到的色谱峰参数设置为:质量数窗口为5ppm,保留时间窗口为0.3min,碎片匹配6.Chemicalconfirmation:evaluatingthechromatographicandmassspectrometricbehaviorofthestandardandtentativelyidentifiedcom-pounds;parametersofpeaksetting:masswindowof5ppmandreten-tiontimewindowof0.3min,fragmentmatch最终识别阿特拉津,敌草隆,2-叔丁氨基-4-环丙氨基-6-甲硫基-s-三嗪,异丙隆,去草净,特定津为海洋藻类光合作用的主要抑制剂Thestudyshowsthatatrazine,diuron,ir-garol,isoproturon,terbutrynandterbu-tylazinearethemaincontributorsofphoto-synthesisinhibitorsofpelagicmarinealgae.[15]线性离子阱高分辨质谱(赛默飞世尔)LTQOrbitrapmassspec-trometer(ThermoFisherScientific)1.基于电喷雾离子化和大气压光电离离子化模式进行质谱全扫,扫描范围为115～1000Da1.FullscanbasedontheionizationofcompoundsbyESIandAPPI,theaccuratemassrangeoffullscanwasfrom115to1000Da2.导入基于标样的目标离子清单和无标样的可疑离子清单进行搜索2.Screeningbytargetionlistandsuspectedionlist3.全扫图谱提取参数设置为:质量数窗口为5ppm,同位素模式匹配相对强度偏差为20%,检验离子化模式的合理性3.Parametersoffullscanchromatogram:masswindowof5ppm,rela-tiveintensitytolerancewassetat20%,checkedfortheplausibilityoftheionizationmode4.可疑化合物的离子碎片与标样或MassFrontier软件预测的碎片匹配4.FragmentsofsuspectedcompoundsmatchwithfragmentationofstandardsandpredictedfragmentationbyMassFrontier最终发现杀虫剂,麝香香料,个人护理品是湖泊沉积物最频繁检出的化合物和新型化合物如季铵盐表面活性剂,三氯生的转化产物Theresultsshowthatbiocides,muskfra-grances,andotherpersonalcareproductswerethemostfre-quentlydetectedcom-pounds.Andsuspec-tedcompoundslikequaternaryammoni-umsurfactants,transformationprod-uctsoftriclosanweredetected.[45]

续表1

线性离子阱高分辨质谱(赛默飞世尔)LTQOrbitrapmassspec-trometer(ThermoFisherScientific)1.目标化合物准确质量数提取,质量偏差小于5ppm1.Exactmass:masserrorofallcompoundswas<5ppm2.峰响应强度参数设置为:强度低于105或者空白与样品在相同保留时间下强度类似视为无效峰,响应强度大于1052.Parametersofpeakintensities:peaksfromtheextractedchromato-gramwerediscardediftheintensitiesofpeakintheextractedchromato-gramwere<105orifapeakofsimilarretentiontimeandintensitieswasfoundintheblanksample,peakintensityvalue≥1053.同位素模式匹配:相对强度偏差为20%3.IsotopeFit:relativeintensitytolerancewassetat20%4.离子化效率:检验可疑转化产物离子化模式的合理性4.IonizationEfficiency:checkedfortheplausibilityoftheionizationmodeoftheproposedtransformationproducts5.质谱碎片解析:碎片对应的分子式必须是母体化合物的构成单元,转化产物与母体化合物的碎片图谱类似,观察到的碎片与MassFrontier软件预测的离子碎片匹配5.InterpretationofMSfragments:exactmassoffragmentsyieldingres-onablemolecularformulas,fragmentspatternoftransformationprod-uctssimilartoparentcompound,matchwithfragmentpredictionbyMassFrontier6.标样验证:在准确质量数提取下标样和样品的碎片匹配,保留时间匹配,子离子比例和强度类似6.Confirmationwithreferencestandards:compareexactmassoffrag-mentsinstangardsandsamples,peakmatchingbyretentiontime,ionratiosandintensities最终发现了天然水体19种转化产物包括经常检测的转化产物如二丁基阿特拉津,异丙甲草胺乙烷磺酸钠盐和很少报道的药物转化产物如N-甲基-4-(3,4-二甲氧基苯基)-4-氰基-5-己基甲胺,O-去甲文拉法辛和嘧菌酯酸19transformationproductswereidenti-fied,includingbothsomewell-knownandcommonlydetec-tedtransformationproducts,andsomerarelyreportedones(e.g.,biotransforma-tionproductsofthepharmaceuticalsven-lafaxineandverapam-il,orofthepesticideazoxystrobin).[46]飞行时间质谱(沃特世)time-of-flightmassspectrometry(Waters)1.基于电子撞击离子化模式进行质谱全扫,扫描范围为50～650Da1.FullscanbasedontheionizationofcompoundsbyEI,theaccuratemassrangeoffullscanwasfrom50to650Da2.利用MassLynx软件中ChromaLynx模块对数据进行去卷积处理得到单一化合物的质谱图2.A"clean"spectrumforeachunknowncomponentwasobtainedbythede-convolutionpackageChromaLynxofMassLynxsoft3.化合物具有4个高丰度的离子碎片3.Fourabundantionsinchromatogramsofcompounds4.峰形确认:自己定义的扫描宽度、光谱排斥因子和5%峰高时的峰宽都满足要求4.Peakconfirmation:peakwasfoundtosatisfyuserdefinedparameterssuchasscanwidth,spectrarejectionfactor,peakwidthat5%height5.库搜索匹配:化合物图谱与NIST质谱库匹配,匹配度大于70%5.Librarymatch:massspectrumofcompoundmatchwithNISTlibrar-y,thefitfactor>70%6.库匹配的分子式提交给ElementalCompositioncalculator工具得到5个高丰度的碎片离子和分子式,碎片离子的质量偏差小于3.0mDa6.Theformulafromthelibraryhitwassubmittedtoanelementalcomposi-tioncalculator,andmasserrorforfivemostintenseionswasbelow3.0mDa最终发现水体中有机微污染物有苯甲酮,佳乐麝香,双酚A,3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯,二嗪农,邻苯二甲酸苄丁酯。Thecompoundswereidentifiedinthewatersamplesincludingbenzophenone,galax-olide,bisphenolA,BHT,diazinon,andbenzylbutylphthalate.[16]

不同高分辨质谱仪器筛选化合物的软件是不一样的，大多数化合物筛选都包括数据的采集(设定扫描范围) 、峰形提取和确认、利用同位素模式和元素组成参数设定获得化合物的分子式、质谱数据库匹配和质谱碎片解析等方面。经过筛选得到的化合物必须通过标样验证才能确定是否存在。

(1)

大多数化合物的不饱和度值低于40。SENIOR法则包含3方面：价态总数或者奇数价态的原子总数是偶数，价态总数≥最高价态的2倍，价态总数≥2×原子数-1。(3)同位素模式筛选，同位素模式是快速确定元素Cl、Br、S存在的工具。质谱仪如飞行时间质谱的同位素丰度模式具有非常低的相对误差，误差在2%～5%之间。利用同位素丰度模式可以排除大量错误的分子式。(4)元素H和C比值检验，所有分子式中超过99.7%的H/C比值在0.2～3.1之间，因此称该范围为正常范围。(5)元素N、O、P、S和C比值检验，基于Wiley massspectral database数据库中45 000个分子式总结得出超过99.7%的N/C比值在0～1.3之间，O/C比值在0～1.2之间，P/C比值在0～0.3之间，S/C比值在0～-0.8之间。(6)元素比例检验，基于Beilstein database和Dictionary of Natural Products数据库中分子量小于2 000的分子式得出如下结论：分子式中N、O、P、S个数都大于1时，必须符合N< 10, O < 20, P < 4, S < 3；分子式中N、O、P个数都大于3，必须符合N < 11, O < 22, P < 6；分子式中O、P、S个数都大于1，必须符合O < 14, P < 3, S < 3；分子式中N、O、S个数都大于6，必须符合N < 19, O < 14, S < 8；分子式中N、P、S个数都大于1，必须符合N < 4, P < 3, S < 3。(7)三甲基硅烷基检验，利用气相色谱质谱联用仪测定有机小分子通常需要进行化学衍生化来提高挥发性、稳定性和灵敏度，衍生化通常是利用N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺的三甲硅烷基化作用来实现。最后获得的化合物扣除三甲基硅烷基基团得到准确的分子式，该分子式必须符合上述法则。

3 基于化合物的色谱保留特征筛选化合物

化合物保留行为的准确预测和研究是利用质谱进行结构识别的主要条件。理论预测的保留指数或保留时间可作为化合物筛选的有效依据。在特定保留指数范围以外的化合物将作为错误的候选者被除去，从而进一步减少化合物的数量。定量结构保留相关关系(quantitative structure-retention relationships, QSRR)可以将分析物的化学结构和物化性质、保留行为等联接起来，因此它可作为化合物保留指数的预测模型，为化合物筛选奠定基础。定量结构保留相关关系QSRR已经在气相色谱和液相色谱中得到了运用，选择合适的描述符对化合物的筛选起关键作用[48]。化合物的色谱分离主要包括液相色谱分离和气相色谱分离。液相色谱和气相色谱分离的原理不同，色谱行为也不同。因此基于色谱保留特征筛选化合物包括基于液相色谱保留特征筛选化合物和基于气相色谱保留特征筛选化合物这2个方面。

3.1 基于液相色谱保留特征筛选化合物

液相色谱是基于化合物在流动相和固定相之间的分配系数，吸附能力等亲和力的不同实现分离。反相液相色谱是液相色谱使用最频繁的技术，可以用于强极性化合物的分离。正辛醇-水分配系数LogKow和线性溶剂化能(linear solvation energy relationships, LSER)相关的溶剂化结构参数等液相色谱描述符可用来预测化合物的色谱行为[49]。众所周知，正辛醇-水分配系数LogKow可以较好的预测中性化合物在C18柱上的保留特征[50]。因此通过正辛醇-水分配系数LogKow来预测化合物在反相液相色谱的保留行为是化合物结构校验的一种最简单和最频繁使用的方法。

正辛醇-水分配系数LogKow已经在化合物筛选方面得到广泛应用。Kern等[46]筛选天然水体转化产物时，基于92个标准物质(农药、药物和杀菌剂等)的液相保留时间tR与正辛醇-水分配系数LogKow的线性关系，设定通过LTQ Orbitrap质谱筛选得到的化合物必须满足等式(2)，不符合该条件的化合物将被排除在外。

tR=2.20×LogKow+3.65

(2)

Booij等[15]筛选海洋藻类光合作用抑制剂时，基于30个标准物质(三嗪和脲类除草剂等)的液相保留时间tR与正辛醇-水分配系数LogKow的线性关系，设定通过microTOF II质谱筛选得到的化合物必须符合LogKow在2.1～4.1(±0.5)之间，不符合该条件的化合物将被排除在外。

线性溶剂化能相关的溶剂化结构参数也被用作环境非目标污染物筛选的条件。线性溶剂化能相关关系是由亚伯拉罕等[51]建立的，可通过等式(3)获得。

solute property=aA+bB+sS+eE+vV+c

(3)

A，化合物的氢键酸度；B，化合物的氢键碱度；S，极化率和偶极性；E，超额摩尔折射率；V，麦高恩体积。梯度系统中用色谱疏水性指数(chromatographic hydrophobicity index, CHI)代表溶质属性solute property[52]。色谱疏水性指数CHI用于描述化合物在流动相和固定相之间的分配行为，也可用于化合物结构校验。

Ulrich等[53]通过色谱疏水性指数CHI和化合物液相保留时间tR的关系构建等式(4)来计算化合物的色谱疏水性指数CHI实际值。

CHI=4.95×tR-3.88

(4)

其中色谱疏水性指数CHI是指线性梯度系统中洗脱化合物需要的有机改性剂的百分含量。相对于保留时间，色谱疏水性指数CHI主要优势是几乎不受梯度设置如梯度时间和柱规格的影响，可由经验公式(5)获得理论计算值。

CHI(LSERcalc)=-6.75(±0.88)A-34.05(±1.13)B-9.47(±0.98)S+1.71(±0.58)E+35.20(±0.91)V+62.80(±0.87)

(5)

A，化合物的氢键酸度；B，化合物的氢键碱度；S，极化率和偶极性；E，超额摩尔折射率；V，麦高恩体积。作者将化合物色谱疏水性指数CHI理论计算值与实际值的匹配程度作为化合物的筛选条件。

3.2 基于气相色谱保留特征筛选化合物

气相色谱是基于化合物沸点、极性和吸附性的差异实现分离。气相色谱作为高温条件下可以气化并且结构不被破环的化合物分析的主要色谱工具，所以环境中许多非极性和中等极性化合物的分离通过它来实现。强极性化合物需要衍生化来增加其挥发性以便在气相色谱上实现分离。保留指数(retention indices, RI)是气相色谱中识别有机物的重要参数，其算法有2种：(1)由科瓦茨[54]提出的用于等温条件下保留指数的计算称为保留指数或者科瓦茨指数；(2)由范杜克和克拉茨[55]提出的用于程序升温条件下保留指数的计算称为线性保留指数或者程序升温保留指数。大多数化合物的保留指数RI与大气压下化合物的沸点(boiling point, bp)具有一致性，因此化合物的沸点已经用于保留指数的估计[56]。通过保留指数计算得到的化合物实际沸点值与理论沸点值是否匹配可作为化合物的筛选条件。

Eckel等[57]将370个不同类型的化合物通过含95%甲基硅氧烷和5%苯基硅氧烷毛细管柱实现分离，化合物的沸点bp是通过美国环保局官方软件EPI Suite的物化数据库和MPBPWIN模块获得，保留指数RI是通过自动质谱解卷积识别系统AMDIS程序获得。最后通过沸点bp和保留指数RI的关系构建等式(6)，

bp=0.98×RI+24.36

(6)

95.1%的点落在等式(7)和等式(8)之间，只有少部分化合物在这个区间之外。

bp=RI-10

(7)

bp=RI+50

(8)

因此设定化合物沸点值必须落在等式(7)和等式(8)区间作为化合物的筛选条件。利用该筛选条件可以显著减少候选清单中的化合物数量，使化合物的筛选变得简单化。

4 基于合适的模型筛选化合物

建立合适的模型可以为化合物的筛选减轻困难，筛选出最有可能的致毒物质。首先有些模型已经被用于环境中关键毒物的鉴别。McLachlan等[58]基于化学品排放、归趋、生物累积的高通量模型(risk assessment identification and ranking model, RAIDAR)来筛选特定环境介质中215种有机硅化学品，最终找到3种之前未被视为潜在环境污染物的新型有机硅化合物。Wang等[59]基于分子动力学模拟发现Helix12是雄激素受体配体结合功能位点上的重要元件，通过Helix12相对稳定时间与毒性值的回归关系来筛选具有抗雄激素活性的羟基化及甲氧基化多溴联苯醚。还有一些成功的模型可能在化合物筛选领域发挥作用。包括以下几个方面：(1)用于预测化合物物化性质的模型。如Ulrich等[53]基于软件ACD/ADME Suite 5.0.7 Absolv模块得到化合物的氢键酸度、氢键碱度、极化率和偶极性、超额摩尔折射率和麦高恩体积等参数值，进而建立色谱疏水性指数CHI与这些参数的关系模型。该模型可以用于模拟化合物的色谱疏水性指数。(2)基于特定效应构建合适模型，将化合物对接到合适模型，通过打分排序等方式筛选得到受体蛋白的抑制剂。如Evers等[60]基于牛视紫红质的X射线结构Alpha1A肾上腺素受体进行同源建模，将23 000个筛选化合物对接到Alpha1A肾上腺素受体同源模型中，通过打分值对化合物进行排序，最终筛选出37个化合物为Alpha1A肾上腺素受体的拮抗剂。Slynko等[61]基于人体蛋白激酶C相关激酶PRK1功能位点进行同源建模并优化模型，将化合物对接到蛋白质上，利用结合自由能进行打分排序，建立自由能计算值与半数抑制浓度实验值的回归关系，从而筛选出蛋白激酶C相关激酶1(PRK1)的抑制剂。Srinivasan等[62]基于人类Nek6蛋白进行同源建模，利用分子动力学模拟找到Nek6蛋白的活性位点，将潜在抑制剂对接到Nek6蛋白活性位点，通过打分值、能量和氢键作用对化合物进行排序，最终筛选出INH-NAD加合物和霉酚腺嘌呤二核苷酸类似物为Nek6蛋白的新型抑制剂。(3)基于数据库资源通过虚拟筛选以及毒性数据排查来筛选化合物。如Carosati等[63]基于ZINC数据库发现10 745个喹喔啉类似物，通过分子量、水溶性和极性表面积筛选得到1 568个化合物，接着通过相识度量FLAP程序虚拟筛选和ADME/Tox毒性数据排查，最后发现偶氮喹喔啉为叶酸循环抑制剂。目前模型已经在药物筛选方面得到广泛应用，未来将在环境污染物筛选和生物代谢物筛选等领域扮演着重要的角色。

4种筛选方法中数据库筛选是其它3种筛选方法的基础，化学数据库可以服务于色谱保留特征筛选和模型筛选，质谱数据库可以服务于高分辨率质谱筛选。4种筛选方法可以2种或者3种联合使用服务于非目标污染物筛选。Hernández等[16]筛选水体有机微污染物时利用了高分辨质谱筛选和数据库筛选这2种筛选方法。Booij等[15]筛选海洋藻类光合作用抑制剂时利用了高分辨质谱筛选、数据库筛选和色谱保留特征筛选这3种筛选方法。McLachlan等[58]筛选环境污染物时利用了高分辨质谱筛选、数据库筛选和模型筛选这3种筛选方法，最终成功筛选出3种新型有机硅化合物。

5 结论与展望

非目标化学品鉴别筛选作为1种高通量的筛选方法，有利于提高从大量化合物中筛选出致毒化合物的效率。目前非目标化学品鉴别在环境领域得到了一定的应用，识别到的污染物包括新型污染物和常规检测的优控污染物等。但是目前化合物筛选方法还存在着一些问题：(1)高分辨率质谱的价格昂贵，一定程度限制了其应用的广泛性；(2)化合物搜索的数据库资源有限，只有一部分化合物含有质谱图谱，并且很多质谱数据库是商业性质的，从而限制了化合物信息的获取；(3)化合物的色谱保留行为随仪器以及操作条件的不同而改变，需要有相对固定和统一的色谱条件；(4)对于模拟方法的使用不广泛。鉴于非目标化学品鉴别在环境领域的成功应用以及研究的不断深入，非目标化学品鉴别筛选将在以下几个方面得到完善和突破。(1)应用范围扩大化，基于非目标化学品鉴别具有的优势，其将在环境、食品、药物、生物代谢物等领域得到广泛应用；(2)数据库资源的完善，随着计算机技术、通信技术和互联网技术的不断发展与进步以及资源共享趋势，免费公开的网络数据库将越来越多，数据库资源也将不断得到补充；(3)计算机模拟在化合物识别中的应用，模拟相对于实验具有快速、简单和花费少等优点，可以选择不同模拟方法平行计算，规避模拟过程带来的不确定性。总之，非目标化学品鉴别作为主要致毒物的识别方法，有助于污染物溯源，降低风险，是环境管理的前提。非目标化学品鉴别方法是一个新兴的方法，需要化学工作者、计算机工作者、政府部门以及国际组织等的合作。正确和高效的使用高分辨率质谱和数据库，建立广谱的色谱保留公式和模拟方法，可以为化学品管理相关法规的制定、环境质量的提高等方面提供基础数据。

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◆

Development and Application of Nontargeted Analysis in Effect Directed Analysis

Deng Dongyang, Yu Hongxia, Zhang Xiaowei, Shi Wei*

State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023, China

5 November 2014 accepted 29 December 2014

Due to the production and widespread use of a variety of chemicals in modern society, surface water, groundwater, sediments and soils are contaminated, which may pose a threat to human health and ecosystem. Effect Directed Analysis (EDA) has been successfully applied in toxicants screening in water and sediments. Structure elucidation in EDA is a key and challenging task because of the complexity of pollutants, the variable polarity, high matrix interferences, the presence of isomers and the lack of available standards. The development of chromatography and mass spectrometry and database searches play a crucial role in screening and identification of compounds. In this paper, methodology including screening and identification of toxicants using high resolution mass spectrum, database, chromatographic retention and modeling is reviewed. The application of nontargeted analysis in the emerging contaminants and drug screening is included. Furthermore, the limitations and prospects of screening and identification of nontarget toxicants are also discussed. This method will improve the accuracy and throughput of identification of nontarget pollutants and reduce the adverse effects that are derived from the complexity of samples and high matrix interferences. It is also helpful to confirm the occurrence of unknowns.

identification of nontarget toxicants; high resolution mass spectrum; database; chromatographic retention characteristics; model

国家自然科学基金青年项目(21307054)；江苏省自然科学基金青年项目(BK20130551)；国家高技术研究发展计划(863计划)“典型化工区化学品风险甄别与控制综合示范”子课题(2013AA06A309)；高等学校博士学科点专项科研基金新教师基金(20130091120013)；江苏省环境监测科研基金(1212)；国家水体污染控制与治理重大专项专题研究(2012ZX07101-003)

邓东阳(1989-)，男，硕士，研究方向为环境分析化学，E-mail: dongyangdeng@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: njushiwei@nju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141105001

2014-11-05 录用日期：2014-12-29

1673-5897(2015)2-13-13

X171.5

A

史薇(1984—)，女，环境科学博士，副教授，主要研究方向为内分泌干扰物的高通量筛选与风险评估和复合污染介质中有机毒物分级鉴别与生物可利用性，发表学术论文20余篇。

邓东阳, 于红霞, 张效伟, 等. 基于毒性效应的非目标化学品鉴别技术进展[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 13-25

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