鼻咽癌组织中iNOS的表达与微血管密度计数的研究

刘汝洋 高国芬 杜志华

(1.泰山医学院，山东泰安271000;2.贵阳医学院，贵州贵阳550004)

鼻咽癌组织中iNOS的表达与微血管密度计数的研究

刘汝洋1高国芬2杜志华1

(1.泰山医学院，山东泰安271000;2.贵阳医学院，贵州贵阳550004)

目的探讨诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌生物学行为的关系，探讨肿瘤血管生成与鼻咽癌生物学行为的关系，探讨iNOS的表达与鼻咽癌血管生成的关系。方法采用非生物素二步免疫组化法，检测iNOS在鼻咽癌组织中表达，并根据CD34相关抗原标记血管内皮细胞。结果鼻咽癌组织中MVD显著高于慢性鼻咽炎组织(27.7±8.88 vs 9±3.1，P＜0.05)。MVD与年龄、性别无关，临床分期Ⅲ、Ⅳ期组的MVD显著高于Ⅰ、Ⅱ期组(30.7±4.7 vs 22.2±7.5，P＜0.05)。淋巴转移组MVD显著高于淋巴结未转移组(29.6±4.8 vs 20.5±4.8，P＜0.05)。iNOS在鼻咽癌组织中阳性表达率为56.25%，iNOS的表达与年龄、性别无关。临床分期Ⅲ、Ⅳ期组iNOS的阳性表达率为70.97%，显著高于Ⅰ、Ⅱ期组29.41%(P＜0.05)。淋巴转移组iNOS的阳性表达率为65.79%，显著高于淋巴结未转移组20.00%(P＜0.05)。iNOS阳性表达组的MVD显著高于iNOS阴性表达组(30.0±5.4 vs 24.0±6.0，P＜0.05)。结论血管生成及iNOS的表达与鼻咽癌生物学行为关系密切。iNOS表达促进了鼻咽癌血管生成及颈淋巴结的转移。测定MVD及iNOS的表达有助于判断鼻咽癌的恶性程度及预后。

鼻咽癌;血管生成，微血管密度;诱导型一氧化氮合酶;免疫组化

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方高发的上皮源性的恶性肿瘤，其发病率居我国头颈部恶性肿瘤首位［1］。恶性肿瘤的生长、浸润及转移过程受多种因素的影响。近年来，越来越多的研究表明，实体肿瘤的生长与转移具有血管生长依赖性。新生血管不但为其生长提供营养、排泄代谢产物，而且为其转移提供通道［2］。肿瘤诱导的血管生成与其生物学行为密切相关。本课题通过免疫组织化学的方法检测鼻咽癌组织中iNOS的表达和微血管密度(MVD)，旨在探讨iNOS在鼻咽癌组织中表达及其与MVD、肿瘤浸润、转移的关系，对进一步研究鼻咽癌的生物学特性，了解其机制可能有一定的理论价值和临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集贵阳医学院附属医院2005年12月—2007年9月门诊耳鼻喉科纤维镜室鼻咽部鳞状细胞癌活检组织及贵阳医学院附属医院病理科部分存档鼻咽部鳞状细胞癌活检组织蜡块48例，慢性鼻咽炎活检标本13例。48例鼻咽癌患者中，男32例，女16例，年龄18～71岁，平均46岁，全部病例活检前均未经放疗和化疗。按照鼻咽癌TNM分期标准(92福州标准)进行临床分期:Ⅰ期6例，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期13例(其中Ⅰ期、Ⅱ期定为早期，Ⅲ期、Ⅳ期定为晚期)。根据颈部是否有淋巴结转移分为颈部淋巴结转移组和非转移组:其中颈部淋巴结转移组38例，非转移组10例。所有标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色复查确诊。

1.2 主要试剂兔抗人iNOS、兔抗人CD34购自武汉博士德生物工程有限公司，PV6001、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法采用非生物素二步免疫组化法，检测iNOS在鼻咽癌组织中表达，并根据CD34相关抗原标记血管内皮细胞。石蜡切片脱蜡和水化后，抗原热修复，H2O2孵育阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗(iNOS和CD34)，孵育，PBS冲洗，滴加PV6001，孵育，PBS冲洗，加DAB溶液，苏木素复染;切片干燥、透明，树胶封固。

以上实验步骤均按试剂盒说明书进行;用已知阳性切片(乳腺癌切片)作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照，每张切片作常规HE染色。

1.4 结果判定

1.4.1 iNOS表达的判断标准以细胞质中出现棕黄色颗粒为表达阳性。综合染色强度和阳性细胞数量进行分级。(1)按着色强度积分:基本未着色，染色与背景相似者为0分;着色浅，略高于背景者为1分;中度着色，明显高于背景者2分;强染，着色深棕色者为3分。(2)按阳性细胞比例积分:在高倍镜下(×400)随机选取5个阳性细胞数多的视野进行计数，计数阳性细胞及总细胞数，求出阳性细胞所占总细胞的百分比，取其平均值，并进行计分:无细胞染色为0分;阳性细胞≤25%为1分;阳性细胞占26%～50%为2分;阳性细胞占51%～75%为3分;阳性细胞＞75%为4分。若两项积分之和＞2分则判定表达阳性;≤2分判定为表达阴性。

1.4.2 肿瘤微血管密度(MVD)的计数方法参照Weidner等［3］报道的方法，先在低倍镜下(100倍)寻找微血管最密集的区域(hot spot)，通常位于肿瘤的边缘;然后在高倍镜(400倍)观察，以能清楚地与周围的微血管分开，且被CD34染成棕色的单个血管内皮细胞或血管内皮细胞丛作为一个可以计数的微血管。计数3个高倍镜的微血管数目，取均数作为MVD值。

1.5 统计学处理采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行处理。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验;计数资料构成比差异用χ2检验和Fisher确切概率法检验;P≤0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 MVD与鼻咽癌CD34阳性表达呈棕黄色，位于血管内皮细胞的细胞浆和(或)细胞膜中。慢性鼻咽炎组织中微血管均分布在粘膜下结缔组织、淋巴细胞浸润的组织中(图1)。鼻咽癌组织中微血管分布不均，形态不规则，肿瘤的边缘微血管密度最高(图2)。48例鼻咽癌组织中MVD为27.7±8.88，13例慢性鼻咽炎组织MVD为9.0±3.1，两组之间有显著差异(t=7.42，P＜0.05)。MVD与年龄、性别无关。临床分期中Ⅲ、Ⅳ期组的MVD显著高于Ⅰ、Ⅱ期组(P＜0.05)。淋巴转移组的MVD显著高于淋巴结未转移组(P＜0.05，)见表1。

图1 慢性鼻咽炎组织中MVD的分布(×400)

图2 鼻咽癌组织中MVD的分布(×400)

表1 MVD与鼻咽癌临床病理特征的关系(¯x±s)

2.2 iNOS的表达与鼻咽癌慢性鼻咽炎上皮细胞iNOS表达为阴性，间质细胞偶有表达iNOS(图3)。在鼻咽癌组织中iNOS主要表达于鼻咽癌细胞胞质中，周围炎症细胞偶有表达(图4)。48例鼻咽癌组织中iNOS阳性表达率为56.25%(27/48)。iNOS的表达与年龄、性别无关(P＞0.05)，而与临床分期及是否有颈淋巴结转移有关(P＜0.05)，见表2。由于所得鼻咽癌组织标本中91.67%(44/48)为低分化鳞癌，中分化鳞癌和高分化鳞癌较少，后者样本含量小，对组织学分化程度无法进行统计处理。

2.3 iNOS的表达与MVD的关系iNOS的阳性表达组27例MVD为30.0±5.4，iNOS阴性表达组21例MVD为24.0±6.0，两组间差异有统计学意义(t =3.64，P＜0.05)。

图3 慢性鼻咽炎组织中iNOS的表达(×400)

图4 鼻咽癌组织中iNOS的表达(×400)

表2 iNOS与鼻咽癌临床病理特征的关系

3 讨论

实体肿瘤的生长和转移与其血管形成有密切关系，甚至有人提出“无血管就无肿瘤”的学说。Weidner等［4］报道可用测量肿瘤中MVD来评价肿瘤血管生成，MVD是乳腺癌患者的一个独立的预后指标。此后，国内外许多学者的研究证实了MVD在膀胱癌、胃癌等的预后价值［5-6］。本研究结果表明，鼻咽癌组MVD显著高于慢性鼻咽炎组，且慢性炎症组织中微血管分布在粘膜下结缔组织及淋巴组织中，而鼻咽癌组织中微血管分布不均，形态不规则，多在肿瘤的边缘处密度最高。临床分期中Ⅲ、Ⅳ期组的MVD高于Ⅰ、Ⅱ期组，二组间有显著性差异(P＜0.05)，说明新生的肿瘤血管可增大肿瘤细胞进入血循环的机率，新生血管越多，表明能诱导血管生成的肿瘤细胞数量越多;颈淋巴结转移组的MVD高于颈淋巴结未转移组，二组间有显著性差异(P＜0.05)说明MVD与鼻咽癌的发展、转移相关，并且MVD越高，鼻咽癌发生转移机率也越高。由于目前对内皮细胞免疫标记的抗体尚不能区分淋巴管及血管，因此可以推测在肿瘤组织内所标记的新生血管中包含新生淋巴管成分。因为促血管生成因子同样也可对淋巴管内皮具有促分裂和增殖作用，从而诱导淋巴管生成［7］。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是体内最小的生物活性物质之一。iNOS合成的NO可以通过抑制细胞DNA复制降低呼吸链中关键酶的活性，也可以通过生成具有强氧化性的OH·自由基途径而发挥细胞毒性作用，造成DNA链的断裂、交叉联结等多种DNA损伤;或通过氧化应激形成过氧化亚硝酸盐造成DNA损伤，从而引起基因突变［8］。此外，Ambs等［9］研究结肠癌中iNOS与p53表达相关关系，认为iNOS与p53表达之间有显著相关性，iNOS表达可导致p53基因突变。而野生型p53基因合成的蛋白作为细胞生长的监控器，监控着体内基因组的稳定，它能识别DNA损伤，让细胞停留在G1期，使得细胞有足够的时间进行修复或凋亡，从而消除可能致癌的异常细胞。本研究结果表明，iNOS在鼻咽癌组织中表达率为56.25%，而在慢性鼻咽炎组织中不表达。故推测NOS可能在分子水平参与了鼻咽癌的发病机制，效应分子即为具有细胞毒性作用的NO。

本组研究显示iNOS的表达与年龄、性别无关，而在不同的临床分期中iNOS表达具有显著差异，Ⅲ、Ⅳ期组iNOS的阳性表达率为70.97%，显著高于Ⅰ、Ⅱ期组29.41%(P＜0.05)。并且淋巴转移组iNOS的阳性表达率为65.79%显著高于淋巴结未转移组20.00%(P＜0.05)。表明iNOS与鼻咽癌的生长、发展和转移密切相关。一般认为NO在肿瘤进展中起着双刃剑的作用，与肿瘤组织局部NO密度［10］、肿瘤类型［11］等有关。持续低浓度(10-9mol ·g-1或10-12mol·g-1)的NO作为肿瘤细胞信号传导途径中重要的信使分子，调节与细胞增殖相关基因的表达，增加肿瘤血供和血管生成，促进肿瘤生长、侵袭、转移。高浓度(10-6mol·g-1)的No可以通过与活性中心Fe-S部位结合使细胞代谢关键酶如三羧酸循环中的顺乌头酸酶等失活从而影响细胞的能量代谢［12］;与超氧阴离子结合生成氧自由基造成DNA损伤等从而产生细胞毒性［13-14］;介导巨噬细胞活化而抗肿瘤［15］等途径抗肿瘤。本组实验显示iNOS的阳性表达组27例MVD的30.0±5.4，iNOS阴性表达组45例MVD为24.0±6.0，两组间有显著性差异(P＜0.05)。提示鼻咽癌组织中肿瘤细胞内有iNOS产生的NO处于相对较低水平，促进鼻咽癌血管生成，进而促进鼻咽癌的生长、侵袭及转移。

以上研究表明，NO在鼻咽癌的发病、生长、发展和转移的很多方面发挥作用，开发NO供体药物和iNOS特异性抑制剂，并与放疗、化疗、生物反应调节剂恰当地结合运用，必将为鼻咽癌治疗带来可喜前景。

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Relationship between iNOS expression and angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma

LIU Ru-yang1GAO Guo-fen2DU Zhi-hua1
(1.Dept.of Otorhinolaryngology，Taishan Medical University，Taian，271000，China; 2.Dept.of Otorhinolaryngology，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China)

Objective:To explore the relationship between angiogenesis and biological behavior of nasopharyngeal carcinoma(NPC)，the relationship between the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and biological behavior of NPC and the relationship between the expression of iNOS and angiogenesis of NPC.Methods:The expression of iNOS and micro vessel density(MVD)were assessed by immunohisto±chemical methods in 48 specimens of NPC and in 13 specimens of chronic nasopharyngitis.The immuno-staining results and related chinical-pathological materials were analyzed by statistical methods.Results:MVD in NPC was significantly higher than that in chronic nasopharyngitis tissues(27.7± 8.88 vs 9±3.1，P＜0.05).MVD in NPC was not related to such factors as age and gender.MVD ofⅢandⅣstages was higher than that ofⅠandⅡstages(30.7±4.7 vs 22.2±7.5，P＜0.05).MVD of cases with lymphatic metastasis was significantly higher than that without lymphatic metastasis(29.6±4.8 vs 20.5±4.8，P＜0.05).The positive staining rate of iNOS was 56.25%.The expression iNOS was not related to age and gender.The positive expression rate(70.97%)of iNOS in cases ofⅢandⅣstages was higher than that(29.41%)in cases ofⅠandⅡstages(P＜0.05).The positive expression rate(65.79%)of iNOS in cases with lymphatic metastasis was higher than that(20.00%)without lymphatic metastasis(P＜0.05).MVD in the cases with positive expression of iNOS was higher than in the cases with in the cases with negative expression(30±5.4 vs 24±6.0，P＜0.05).Conclusion:Angiogenesis of NPC is significantly related to the biological behavior of NPC.The expression of iNOS is related to the biological behavior of NPC.The detection of MVD and the expression of iNOS in NPC can be used as indexes to determine the degree of malignancy and prognosis.

nasopharyngeal carcinoma;angiogenesis，MVD;iNOS;immunohistochemistry

R739.62

A

1004-7115(2015)01-0003-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.01.002

2014-11-11)

刘汝洋(1979-)，男，山东泰安人，讲师，硕士，主要从事耳鼻咽喉科学临床工作。