新疆传统酸奶中乳酸菌的筛选鉴定及菌相分析

杨 洁,张文亮,邹建军,胡 敏,袁雪林,刘云国

(新疆大学 生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)

新疆传统酸奶中乳酸菌的筛选鉴定及菌相分析

杨 洁,张文亮,邹建军,胡 敏,袁雪林,刘云国*

(新疆大学 生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)

酸奶是新疆各少数民族经常食用的一种乳制品。从新疆采集的22个酸奶样品中共分离出56株乳酸菌,通过形态特征观察、生理生化实验、糖发酵实验等传统鉴定方法,结合16S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明,新疆传统酸奶中菌相构成为德氏乳杆菌(Lactobacillus.delbrueckiisubsp.)46株(占总分离株的82%);发酵乳杆菌(Lactobacillus.fermentum)2株(4%);瑞士乳杆菌(Lactobacillus.helveticus)2株(4%);嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)1株(2%);鸡乳杆菌(Lactobacillus.gallinarum)2株(4%);屎肠球菌(Enterococcusfaecalis)1株(2%);耐久肠球菌(Enterococcuscanis)2株(4%)。说明新疆传统酸奶中德氏乳杆菌为优势菌。

新疆传统酸奶,乳酸菌,菌相,16S rDNA序列分析

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1]。这类细菌在自然界分布广泛,在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域中应用价值很高。目前至少可分为18个属,共有200多种。除极少数外,其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群,广泛存在于人体的肠道中。新疆地域辽阔,自然环境和气候差异都很大,新疆农牧民制作酸奶的经验丰富、历史悠久,乳酸菌资源具有无可比拟的生物多样性和基因多样性[2-4]。因而,筛选鉴定新疆传统酸奶中的乳酸菌并分析其菌相构成具有重要的意义。

生理生化实验及糖发酵实验是一种常见的细菌鉴定方法,每一种细菌的生命活动和新陈代谢都是独一无二的,他们的新陈代谢活动和其代谢产物也不尽相同[5-7]。近年来,随着分子生物学技术的快速发展,16S rDNA序列测定技术也应用到了细菌的鉴定及菌相构成分析中[8-11]。细菌的16S rDNA基因大小适中,既含有高度保守序列,也具有相当的变异区,是一种简单、快速的在种、属水平上鉴定大量菌株遗传关系的方法,通过构建细菌系统发育树,能够较好地反映出属、种分类地位和系统进化亲缘关系,为细菌种属鉴定和近缘种研究提供可靠依据[12]。

本研究从新疆喀什地区采集的22个酸奶样品中共分离得到56株乳酸菌,通过形态特征观察、生理生化实验、糖发酵实验等传统鉴定方法,结合16S rDNA序列分析对其进行了鉴定和分类,分析了新疆传统酸奶中的菌相构成。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 采集自喀什及周边地区农牧民家中,其中采自喀什市的样品7份、阿图什市4份、塔什库尔干县11份,共计22份样品。利用样品无菌采集管采集酸奶样品,每一样品分3份于冰盒保存,12小时内送于实验室-70℃保存,备用。

过氧化氢,卢戈氏碘液,结晶紫,番红,95%乙醇,吲哚试剂,溴甲酚紫;MRS液体培养基、MRS固体培养基、MC固体培养基、M17固体培养基以及糖发酵基本培养基;无抗生素脱脂奶粉 新疆喀什南达乳业。

超净工作台 苏净集团安泰公司;HZQ-X100培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司;高速冷冻离心机 力康有限公司;SpectrumLab53紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;C100S型PCR仪 美国Bio-Rad公司;pHS-25型pH计 上海精科雷磁有限公司。

1.2 样品的活化

在筛选乳酸菌之前需要将样品活化。按酸乳发酵条件活化样品,即以3%的接种量将样品加入12.5%(w/v)的脱脂乳中,42℃发酵4～6h,待酸乳凝固后按上述条件进行二次发酵后待用。

1.3 乳酸菌的筛选及纯化

首先将活化的样品稀释涂布,取10mL样品加入到90mL无菌生理盐水中,形成10-1的稀释液,随后从中取出1mL加入9mL生理盐水管中形成10-2的稀释液,之后依次稀释成10-3、10-4、10-5的稀释液。分别取0.1mL的稀释液涂布于加有2%(w/v)碳酸钙的MRS培养基、改良MC培养基和M17培养基上,置于37℃恒温培养48h,挑取有融钙圈的单菌落进行划线纯化。

1.4 生理生化及糖发酵实验

筛选及纯化的菌株进行吲哚实验、葡萄糖产酸产气实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、石蕊牛奶实验等生理生化实验及糖发酵实验,参照《常见细菌系统鉴定手册》[1]、《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[13]和《伯杰系统细菌学手册》[14]进行鉴定。

1.5 乳酸菌的发酵以及感官实验

对分离得到的单菌落接入到12.5%的脱脂乳中,发酵4～6h后移入4℃放置6～8h后熟,对其凝乳状态和感官指标进行评价。

1.6 乳酸菌DNA的提取

DNA提取按照试剂盒说明书(Beijing Solarbio)的要求操作,略有改动,第二步添加了溶菌酶,用以乳酸菌破壁。

1.7 乳酸菌16S rDNA PCR扩增

乳酸菌16S rDNA PCR扩增体系见表1。引物采用细菌通用扩增引物,正向引物27f:(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),反向引物1492r:(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。

扩增循环为94℃ 5min,预变性;94℃(1min)、58℃(1min)、72℃(2min),35个循环;72℃延伸10min。扩增完毕后,取3μL PCR扩增产物与2μL loading buffer混合点样,用电泳缓冲液(1×TAE)制备1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,若PCR成功则在1500bp左右可见清晰条带。扩增产物送寄于上海生工生物工程有限公司测序。

表1 16S rDNA PCR扩增体系Table 1 PCR amplification system of 16S rDNA

1.8 16S rDNA序列系统发育分析

代表性菌株的16S rDNA序列通过BLAST获取与所测序列相似度最高的序列,ClustalX进行多重序列比对,利用聚类分析软件Mega 5,采用邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离及菌落特征

在加有2%(w/v)碳酸钙的MRS培养基、改良MC培养基和M17培养基上挑取有明显融钙圈的菌落,进行纯化,共得到56株乳酸菌,实验菌经染色后,在油镜下观察呈现蓝紫色,均为革兰氏染色阳性菌。实验菌的菌体形态可分为两类:球状和短杆状;球状菌均为单个或成链状,短杆菌成单个或成对出现。根据菌落和菌体形态对比,可以发现球状乳酸菌的菌落要比短杆状乳酸菌的菌落小,表2列出了分离到的凝乳状态和感官评价结果较好的11株菌的形态特征。

2.2 生理生化及糖发酵实验

将分离到的56株乳酸菌进行生理生化及糖发酵实验,表3是其中11株菌的生理生化鉴定结果,表4是糖发酵实验结果。

表2 乳酸菌的形态特征Table 2 Characteristics of Lactic acid bacteria

注:“+”表示革兰氏阳性

表3 生理生化鉴定结果Table 3 Result of identification physico-chemical properties

注:“+”表示阳性“-”表示阴性。

表4 糖发酵实验结果Table 4 Results of sugar fermentation

注:“+”表示阳性“-”表示阴性。

由表3可见,产气的菌株为Alt-1-a、Alt-1-b、Alt-2(2)、KS-4-b和KS-5-b(2),属于异型发酵,其余为同型发酵。根据生理生化反应和形态学特征,初步判定所筛选出的球菌HT-b、HT-e、HT-f为链球菌属,杆菌为乳杆菌属。

图1 16S rDNA PCR扩增结果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results

2.3 16S rDNA PCR扩增产物的电泳检测

用1%的琼脂糖凝胶对分离菌的16S rDNA扩增产物进行电泳检测,通过凝胶成像系统照相并观察,图1是其中11株菌的16S rDNA PCR扩增结果。从图1可知,除了Alt-2(2)和Alt-1-a两珠菌外,均有扩增产物。

2.4 16S rDNA序列系统发育树及菌相分析

通过BLAST比对,选取GenBank中16株与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的参比菌株做系统发育树分析(表5)。

图2 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA seaqences

对菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中参比菌株的相应序列进行比较鉴定,用MEGA 5软件以NJ法绘制系统发育树(图2)。BLAST序列比对表明基因序列全部归属于乳酸菌。系统发育分析归为乳酸杆菌科和肠球菌科。所有分离的56株乳酸菌的16S rDNA序列通过BLAST比对鉴定,其菌相构

表5 用于多序列比较的参比菌株Table 5 List of the strains used

成为德氏式乳杆菌Lactobacillusdelbrueckiisubsp.46株,占所筛选菌种数的82%;发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum2株,占所筛菌种数的4%;瑞士乳杆菌Lactobacillushelveticus2株,占所筛菌种数的4%;嗜酸乳杆菌Lactobacillusacidophilusstrain1株,占所筛菌种数的2%;鸡乳杆菌Lactobacillusgallinarumstrain 2株,占所筛菌种数的4%;屎肠球菌Enterococcusfaecium1株,占所筛菌种数的2%;耐久肠球菌Enterococcusduransstrain 2株,占所筛菌种数的4%。说明新疆传统酸奶中菌相构成以德氏乳杆菌为优势菌。

3 结论

新疆喀什、和田等地是中国的长寿之乡,酸奶是当地居民食用量最多的一种乳制品。乳酸菌是世界公认的益生菌,新疆传统酸奶中存在着大量的乳酸菌菌群,其实际应用价值非常高,因而,筛选鉴定新疆传统酸奶中的乳酸菌并分析其菌相构成具有重要的实际意义。本研究从新疆采集的22个酸奶样品中共分离出56株乳酸菌,通过形态特征观察、生理生化、糖发酵实验等传统鉴定手段,结合16S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明新疆传统酸奶中德氏乳杆菌占绝对优势(82%),其他菌株所占比例较小,如发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鸡乳杆菌、屎肠球菌、耐久肠球菌等各占2%～4%。

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Screening,identification and microflora analysis of Lactic acid bacteria from Xinjiang traditional yogurts

YANG Jie,ZHANG Wen-liang,ZOU Jian-jun,HU Min,YUAN Xue-lin,LIU Yun-guo*

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

Yogurt is one of the poplular dairy foods for minority nationalities in Xinjiang. Fifty-six Lactic acid bacteria were isolated from 22 yogurt samples collected from Xinjiang. They were identified by observation of morphological characteristics,physiological and biochemical tests,sugar fermentation tests,and sequence analysis of 16S rDNA. The microflora in Xinjiang traditional yogurts include 46 strains ofL.delbrueckiisubsp,accounted for 82%,2 strains ofL.fermentum,accounted for 4%,1 strains ofEnterococcusfaecalis,accounted for 2%,and 2 strains ofEnterococcuscanis,accounted for 4%. It indicateed thatL.delbrueckiisubspwas the dominant bacteria in Xinjiang traditional yogurts.

Xinjiang traditional yogurt;Lactic acid bacteria;microflora;16S rDNA

2014-02-20

杨洁(1963-)，女，博士，副教授，研究方向：生物化学和天然产物研究。

*通讯作者:刘云国(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术。

TS252

A

1002-0306(2015)01-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.060