银叶树种子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,钟秋平,李丽清

(钦州学院 海洋学院,广西钦州 535099)

银叶树种子蛋白的提取及其功能性研究

熊 拯,钟秋平,李丽清

(钦州学院 海洋学院,广西钦州 535099)

以银叶树种子为原料,考察提取工艺对其蛋白提取率的影响。通过单因素实验对影响银叶树种子蛋白提取率的pH、提取时间、液料比和提取温度等四个因素进行研究,并采用Box-Behnken实验设计和响应曲面分析法确定银叶树种子蛋白提取的最佳工艺条件。结果表明:最佳提取工艺条件为提取温度55℃、pH10、提取时间2h、液料比11∶1,在此条件下蛋白提取率为50.85%;银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳定性优于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。

响应曲面,银叶树种子,蛋白质,提取

银叶树(Heritieralittoralis)是银叶树属红树植物,也称大白叶仔,为梧桐科银叶树属真红树植物,广泛分布于热带海岸,在我国海南、广东、广西和台湾等地均有分布[1]。果实内仅含一粒种子,为其主要药用部位,种子无胚乳,主要由两片肥厚的子叶构成[2],银叶树种子主治腹泻、痢疾[3],其种仁被作为一种滋补品,有一定的食用价值[4]。

目前,国内外学者关于银叶树的研究主要集中于通过溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH.20柱层析、HPLC等方法从该植物的根、茎、叶中分离鉴定化合物[5-7],但是从食品研究开发的角度对银叶树进行的研究非常少。本研究拟采用碱溶酸沉法[8-10]对银叶树种子中的蛋白质进行提取,通过单因素实验考察pH、提取温度、提取时间和液料比四个因素对提取率的影响,并采用响应曲面法对银叶树种子蛋白质的提取条件进行优化,以期为银叶树种子系列食品的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银叶树种子,采自防城港银叶树生态保护区;石油醚,分析纯,成都科龙化工试剂厂;硫酸钾、硫酸铜和硼酸,分析纯,广东光华化学厂有限公司;硫酸、盐酸和甲基红,分析纯,成都科龙化工试剂厂;溴甲酚绿、醋酸和醋酸钠,分析纯,天津市光复精细化工研究所。

80-1型电动离心机 上海梅香仪器有限公司;FA2004型电子分析天平 上海耀杰有限公司;PHS-3CF型精密酸度计,上海大普仪器有限公司;101-3型电热鼓风恒温干燥箱 上海东星建材实验设备有限公司;自动凯氏定氮仪 国药集团化学试剂有限公司;FW-100型高速万能粉碎机 上海胜启仪器仪表有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司;SHB-IIIA型循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银叶树种子脱脂 银叶树果实去壳后,在温度50℃下的烘箱里烘干至恒重,粉碎,过40目筛,按照10∶1(V/W,以下同)的液料比用石油醚脱脂,置于冰箱中冷藏备用。

1.2.2 银叶树种子蛋白等电点的测定 称取10g样品,液料比为10∶1,pH调至10。在温度30℃下磁力搅拌浸提1.0h,离心(4000r/min,20min)取上清液,分取上清液8份各20mL,用醋酸和醋酸钠缓冲溶液分别调pH为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0,离心(4000r/min,20min),出现沉淀量最大时的缓冲溶液pH为银叶树种子蛋白质的等电点。实验中出现沉淀量最大时的缓冲溶液pH为3.5。

1.2.3 银叶树种子蛋白的提取工艺流程 银叶树果实→去壳→干燥→粉碎(过40目筛)→脱脂→搅拌浸提→离心分离(4000r/min,10min)→取上清液→调蛋白等电点→离心分离(4000r/min,20min)→沉淀→干燥→粗蛋白[11]

其中,蛋白质提取率计算如下:

蛋白质提取率(%)=(产品质量×产品中蛋白质的百分含量/样品质量×样品中蛋白质的百分含量)×100

其中,样品为粉碎后的银叶树种子;产品为所提取的蛋白质;蛋白提取液和产品中的蛋白质含量用微量凯氏定氮法测定。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 提取温度的影响 固定pH为10.0,提取时间为1.0h,液料比为10∶1,提取温度设定25、35、45、55、65℃五个水平梯度,考察提取温度对银叶树种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.4.2 pH的影响 固定提取温度为55℃,提取时间为1.0h,液料比为10∶1,pH设定8.0、9.0、10.0、11.0和12.0五个水平梯度,考察pH对银叶树种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.4.3 提取时间的影响 固定提取温度为55℃,pH为10.0,液料比为50∶1,提取时间设定1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h五个水平梯度,考察提取时间对银叶树种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.4.4 液料比的影响 固定提取温度为55℃,pH为10.0,提取时间为2.0h,液料比设定5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1五个水平梯度,考察液料比对银叶树种子蛋白提取率的影响。每个实验点做三次重复。

1.2.5 响应曲面实验设计 应用Design Expert 软件,根据Box-Behnken 中心组合设计原理,在单因素实验结果的基础上,综合考虑实际生产的需要,以银叶树种子为原材料,碱溶pH为X1,提取时间为X2,提取温度为X3,液料比为X4,蛋白提取率Y为响应值,进行响应曲面实验设计,因素水平见表1。在实验设计中,每个实验点重复3 次,结果取平均值。数据分析主要采用散点图、相关分析和回归分析等方法进行。

表1 实验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of the experiments

1.2.6 银叶树种子蛋白功能特性评价方法 本文分别参照相应的参考文献对银叶树种子蛋白的吸水性、吸油性、乳化性、乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性功能性进行评价分析[11-12]。

2 结果与分析

2.1 单因素对银叶树种子蛋白提取率的影响

2.1.1 提取温度的影响 由图1可知,银叶树种子蛋白的提取率随着温度的升高而增加,温度55℃时达到最高值;而提取温度超过55℃,提取率呈现逐渐降低的趋势。因为蛋白质溶解时必须破坏蛋白质之间的相互作用,而加热使蛋白质分子间和分子内的二硫键断裂,亚基伸展,疏水基暴露,使蛋白质的氮溶解指数升高[13];但在温度高于55℃时,随着温度的升高,蛋白质开始变性,蛋白质的氮溶解指数降低。因此,温度选择在55℃较为适宜。

图1 提取温度对银叶树种子蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.2 pH的影响 由图2可知,在pH10时,蛋白质的提取率最好,降低或增加pH均有使蛋白质提取率降低的趋势。可能是由于碱液对蛋白质体系的平衡和多肽链中某些侧链基团的解离程度发生变化的结果。因此,选择pH较为10适宜。

图2 pH对银叶树种子蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of pH on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.3 提取时间的影响 由图3可知,蛋白质的提取率随着提取时间的延长呈现先增大后减小的趋势。这是由于随着提取时间的延长,溶液中的蛋白质出现凝聚沉淀,离心时蛋白质和残渣一同被排除,从而降低了蛋白质的提取率[14-15]。因此,提取时间选择2h较为适宜。

图3 提取时间对银叶树种子蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of time on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.1.4 液料比的影响 由图4可知:当液料比为10∶1时,蛋白质的提取率最高。在液料比由5∶1上升到10∶1,随着液料比的增加,蛋白质的提取率也升高。液料比达到10∶1后继续增加,蛋白质的提取率反而降低了。因此,液料比选择10∶1较为适宜。

图4 液料比对银叶树种子蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction of Heritiera littoralis seed protein

2.2 提取条件的优化

2.2.1 结果回归分析 由单因素实验可知,不同因素对蛋白提取率的影响程度不同,故以pH、提取时间、液料比和提取温度四个因素为可控工艺参数,以提取率为实验指标,采用Box-Behnken设计方法来优化银叶树种子蛋白提取工艺条件,实验设计方案及结果见表2。

利用Design Expert软件,通过表3中实验数据进行多元回归拟合,获得银叶树种子蛋白质提取率对编码自变量pH、提取时间、液料比和提取温度的二次多项回归方程:

Y=52.83+0.61X1+0.21X2+0.49X3-0.37X4+0.68X1X2+0.47X1X3+0.35X1X4-0.1X2X3-0.24X2X4-0.077X3X4-3.31X12-1.29X22-1.24X32-1.62X42

回归方程中各变量对蛋白质提取率影响的显著性由F检验来判定;概率p越小则相应变量的显著性越高[16]。对上述回归模型进行方差分析(表3),结果表明,回归方程极显著,相关系数的平方即R2=97.20%,说明响应值(提取率)的变化有97.20%来源于所选变量,即浸提温度,浸提时间和料液比。因此,回归方程拟合度良好,可利用该方程代替真实实验点进行分析。由P值可知,方程的X1、X3、X1X2、X12、X22、X32和X42对Y值影响极显著,X4、X1X3对Y值影响显著,表明该方程并非简单的线性关系,交互作用对响应值影响很大,方程二次项对响应值影响也很大。失拟项p=0.1890,无显著性影响,表明数据没有异常点,不需要分析更高次数的项,模型适当。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 响应面分析及蛋白质提取条件的优化 通过响应曲面图可以直观地反映实验条件对蛋白质提取效果的影响。由图5可知,提取率随着温度的升高而增加,而提取温度超过50℃,提取率呈现逐渐降低的趋势;提取率随着pH的升高而增加,而pH超过10时,呈现逐渐降低的趋势;提取率提取率随着提取时间的增长而显著增加,而提取时间超过2h,提取率反而有下降的趋势;蛋白质的提取率随着液料比的增加而增加,而液料比超过10∶1,蛋白质的提取率反而降低了。这与单因素实验的结果趋势相同。

表3 回归模型方程的方差分析Table 3 Analysing variance of regression model

图5 各因素交互作用对银叶树种子蛋白提取率影响的响应曲面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the extraction yield of Heritiera littoralis seed protein

注:Pr值是方差齐性检查的结果;**表示极显著水平(p<0.01);*表示显著水平(p<0.05)。

为了进一步求得各因素的最佳条件组合,对回归方程进行数学处理,偏导求零后的极值方程组求解,得到银叶树种子蛋白提取的优化条件为:碱溶pH10.11,时间2.055 h,液料比11.05∶1,温度56.1℃,此时所得蛋白提取率为52.95%。采取上述最优条件进行实验,同时考虑到实际操作的情况,将银叶树种子蛋白质提取条件修正为提取温度55℃、pH10、提取时间2h、液料比11∶1,粗蛋白质量分数为88.53%;实测提取率为50.85%,说明采用响应面分析法优化得到的实验参数是可靠的。

2.2.3 银叶树种子蛋白与大豆分离蛋白的功能性质比较 实验将银叶树种子蛋白与大豆分离蛋白的几种功能性质进行了比较研究[11],实验结果见表4。结果表明,银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳定性优于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。

表4 银叶树种子蛋白和大豆分离蛋白的功能性比较Table 4 Comparing on functionality of Camellia oleifera seed protein and SPI

3 结论

通过单因素实验和Box-Behnken实验设计以及响应面分析对银叶树种子蛋白提取工艺进行了优化,各因素对提取率的影响大小为:碱溶pH>提取温度>液料比>提取时间。结合实际操作,确定提取银叶树种子蛋白质的最优条件是:提取温度55℃、pH10、提取时间2h、液料比11∶1,提取率为50.85%。银叶树种子蛋白的吸水性、起泡性和泡沫稳定性优于大豆分离蛋白;而大豆分离蛋白的吸油性、乳化能力和泡沫稳定性优于银叶树种子蛋白。

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Study on the extraction and function of Heritiera littoralis seed protein

XIONG Zheng,ZHONG Qiu-ping,LI Li-qing

(School of Ocean,Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

The effect of process on extraction rate of Heritiera littoralis seed protein was discussed in this study. The factors of pH,temperature,time,and liquid/solid ratio were studied by single factor experiments,and Box-Behnken design and response surface methodology were applied to confirm the optimum experiment condition. The highest protein extraction rate was 50.85% under the condition:temperature(55℃),pH10,extraction time 2h,liquid/solid ratio 11∶1. The water retention capability,foaming properties and foaming stability of Heritiera littoralis seed protein were better than SPI;the oil-absorbing,emulsifying capacity,and emulsifying stability of SPI were better than Heritiera littoralis seed protein’s.

response surface methodology(RSM);Heritiera littoralis seed;protein;extraction

2014-02-10

熊拯(1981-)，男，硕士，副教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

广西高校科学技术研究项目(2013YB260)。

TS202.1

B

1002-0306(2015)01-0239-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.041