5－Aza－CdR对乳腺癌MCF－7细胞增殖及抑癌基因RASSF2A表达的影响＊

马腾飞， 韦 达， 钟山亮， 张晓慧， 赵建华

5－Aza－CdR对乳腺癌MCF－7细胞增殖及抑癌基因RASSF2A表达的影响＊

马腾飞， 韦 达， 钟山亮， 张晓慧， 赵建华△

南京医科大学附属江苏省肿瘤医院临床检验中心，南京 210009

目的 研究5－氮－2′－脱氧胞苷（5－Aza－CdR）对乳腺癌MCF－7细胞增殖及抑癌基因RASSF2A表达的影响。方法 用不同浓度的5－Aza－CdR处理MCF－7细胞12～96h，四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法和流式细胞仪分别检测药物处理前后细胞的增殖活性和凋亡率；实时荧光定量PCR（RT－qPCR）法检测各阶段RASSF2AmRNA的表达水平，甲基化特异性PCR（MSP）观察该基因甲基化的改变。结果 用1、5、10μmol／L 5－Aza－CdR处理MCF－7细胞24、48、72和96 h后，细胞生长均受到抑制，呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明，3种药物浓度处理细胞72h后凋亡率增加，5和10μmol／L组凋亡率分别为（25.5±3.5）%和（58.2±3.2）%，与对照组（13.4±2.0）%相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RT－PCR检测显示，不同浓度药物处理MCF－7细胞后，RASSF2AmRNA表达水平随着药物浓度的增加而逐步上调；进一步MSP检测发现这些癌细胞中RASSF2A甲基化状态得到了不同程度的逆转。结论 5－Aza－CdR可通过逆转RASSF2A基因异常甲基化导致该基因表达上调来抑制MCF－7细胞增殖，RASSF2A是一个乳腺癌相关抑癌基因。

RASSF2A； 甲基化； 5－Aza－CdR； 乳腺癌

乳腺癌的发生发展是包括癌基因激活和抑癌基因失活的多因素、多步骤长期复杂的演变过程。抑癌基因失活可能涉及多种途径，目前普遍认为DNA甲基化改变是除缺失和突变之外导致抑癌基因表达抑制的第3种机制［1］。5－Aza－CdR是一种DNA甲基转移酶的抑制剂，它通过去甲基化作用能使细胞中多种CpG岛过甲基化的抑癌基因重新表达而恢复后者的抑癌功能［2］。RASSF2A是新近发现的抑癌基因［3］，已报道其对鼻咽癌、胃癌和白血病等癌细胞的生长具有明显抑制作用［4－6］。本研究通过5－Aza－CdR处理人乳腺癌细胞系MCF－7，观察细胞生物学行为以及RASSF2A基因甲基化和表达的改变，探讨该基因在乳腺癌及其治疗中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和药物处理

正常乳腺上皮细胞株HBL－100和人乳腺癌细胞株MCF－7购自中国科学院上海细胞生物所，细胞培养于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100 μg／mL链霉素的DMEM高糖培养液（Hyclone公司）。5－氮－2′－脱氧胞苷（5－Aza－CdR，Sigma公司）配制成0.25mg／mL（1mmol／L）的储存液，以培养液稀释成终浓度为1、5、10μmol／L的工作液。

1.2 MTT法测定5－Aza－CdR对乳腺癌细胞活性的影响

取对数生长期的MCF－7细胞，接种于96孔板，每孔细胞为8×103个。每组设5个复孔，培养24h后去上清液，分别加入含1、5、10μmol／L 5－Aza－CdR的培养液继续培养，在12、24、48、72和96h各时间点分别取1板，每孔加入MTT溶液（5g／L）20 μL。继续培养4h后终止，吸掉孔内上清液，每孔加入150μL二甲亚砜（DMSO），置摇床上振荡10min使沉淀完全溶解，在CliniBio酶标仪选择550nm波长，测定各孔吸光度（A）值，计算各组细胞的抑制率，实验重复3次

1.3 流式细胞仪检测5－Aza－CdR对乳腺癌细胞凋亡的影响

用含浓度分别为5和10μmol／L 5－Aza－CdR的DMEM高糖培养液培养实验组的MCF－7细胞，对照组用单纯的DMEM高糖培养液培养，待72h后分别收集细胞，预冷PBS洗涤2次，用－20℃预冷的700mL／L冰乙醇固定，用RNase（终浓度为0.1 g／L）37℃孵育30min，加入适量的Annexin－Ⅴ和PI室温避光染色30min后，用BD FACS流式细胞仪测定细胞凋亡。每组实验设定5个复孔，重复3次。

1.4 总RNA的提取及RT－PCR检测

分别用1、5和10μmol／L的5－Aza－CdR处理MCF－7细胞72h后，按TIANGEN公司的总RNA提取试剂盒说明书提取对数生长期MCF－7细胞的总RNA，紫外分光光度计（NanoDrop 2000）测定其浓度及纯度。应用Biouniquer公司的cDNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，实时定量PCR采用SYBR GreenⅠmaster mix（Biouniquer公司）试剂盒进行。RASSF2A的上下游引物分别为5′－GCGCCTAGAACGTGTTTTTC－3′和5′－ACTAGGCGT－CCTCACATTGC－3′［7］；内对照β－actin的上下游引物为5′－TGGCACCACACCTTCTACAA－3′和β－actin 5′－AGCCTGATAGCAACGTA－3′［8］。PCR反应条件为95℃预变性10min；95℃变性5s，60℃延伸31s，共40个循环。最后熔解曲线分析，95℃15s，60℃30s，95℃15s。同步扩增RASSF2A和β－actin，以未逆转录RNA为阴性对照，阳性对照为正常乳腺细胞株HBL－100的逆转录产物。RASSF2A相对表达水平的计算方法为2－ΔΔCt，实验重复3次。

1.5 MSP检测

分别用1、5和10μmol／L的5－Aza－CdR处理MCF－7细胞72h后，按照Qiagen DNA提取试剂盒说明书提取细胞基因组DNA，用NanoDrop2000检测DNA的浓度和纯度。取2μg DNA按Qiagen Fast Bisulfite kit说明书进行亚硫酸氢盐修饰纯化回收，参照文献［7］的方法设计RASSF2A基因启动子区甲基化和非甲基化PCR的特异性引物。甲基化PCR上下游引物分别为5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′和5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′；非甲基化PCR上下游引物分别为5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG－3′和5′－AAAAAACCAACAACAACCCCCACA－3′，引物由Invitrogen公司合成。反应条件为95℃预变性5 min，然后94℃变性15s，54℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃终末延伸10min。甲基化和非甲基化的扩增片段都为108bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以UVP凝胶分析系统拍照并分析结果，实验重复3次。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行单因素方差分析和t检验，计量数据以表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5－Aza－CdR对MCF－7细胞增殖的影响

经1、5、10μmol／L 3个浓度5－Aza－CdR处理，MCF－7细胞生长的抑制率变化见图1。随着浓度的增加和时间的延长，MCF－7细胞生长抑制率逐渐升高。

图1 5－Aza－CdR对MCF－7细胞增殖的影响Fig.1 Effects of 5－Aza－CdR on the proliferation of MCF－7cells

2.2 5－Aza－CdR对MCF－7细胞凋亡的影响

5－Aza－CdR作用MCF－7细胞72h后，流式细胞仪分析结果显示5和10μmol／L实验组的凋亡率分别为（25.5±3.5）%和（58.2±3.2）%，与对照组（13.4±2.0）%相比差异有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 不同浓度5－Aza－CdR作用MCF－7细胞72h后细胞凋亡率的变化Fig.2 Changes of the apoptosis rate of MCF－7cells after treatment with 5－Aza－CdR of different concentrations for 72h

2.3 5－Aza－CdR对MCF－7细胞RASSF2A mRNA表达的影响

正常乳腺上皮细胞HBL－100的RASSF2A mRNA表达水平为乳腺癌MCF－7细胞的13.64倍。MCF－7细胞经1、5、10μmol／L 5－Aza－CdR处理72h后，RASSF2AmRNA的相对表达量分别为1.97、3.09、5.16；与未经5－Aza－CdR作用的MCF－7细胞表达相比明显增加，且呈剂量依赖性，见图3。

图3 5－Aza－CdR对MCF－7细胞RASSF2AmRNA表达的影响Fig.3 Effects of 5－Aza－CdR on RASSF2AmRNA expression inMCF－7cells

2.4 RASSF2A基因启动子甲基化分析

MSP检测的结果显示，正常乳腺上皮细胞HBL－100非甲基化的条带明显而甲基化条带微弱。由图4A可见，MCF－7细胞经过1、5、10μmol／L的5－Aza－CdR作用72h，甲基化条带逐渐减弱，非甲基化的条带明显增强。用Image J分析条带得出相对表达量（图4B），随着药物浓度增加，MCF－7细胞的RASSF2A基因甲基化的表达量逐渐降低，而非甲基化的表达量逐渐升高。说明RASSF2A基因启动子在MCF－7细胞中异常甲基化，而在经过5－Aza－CdR去甲基化处理后，该基因甲基化得到一定程度上的逆转，并且去甲基化程度与用药的剂量有一定的依赖性。

图4 5－Aza－CdR对MCF－7细胞RASSF2A基因去甲基化的作用Fig.4 Effects of 5－Aza－CdR on RASSF2Ademethylation in MCF－7cells

3 讨论

恶性肿瘤的发生机制在于细胞内部基因和结构发生了异常改变，即由遗传基因缺陷和表观遗传改变共同引起［9］。表观遗传是通过DNA自身的化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，不存在DNA序列的改变。DNA甲基化是表观遗传中研究最广泛和最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程，这种修饰反应主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上［10］。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式存在的，且启动子非甲基化状态是相关基因特别是肿瘤抑制基因转录的先决条件。一旦启动子区域CpG岛出现异常甲基化将导致抑癌基因转录沉默，失去阻滞细胞恶性转化的作用，该机制已涉及多种肿瘤包括乳腺癌的发生发展［11－12］。

RASSF2是RASSF（RAS－association domain family）家族重要成员，在多种人类肿瘤中均存在其启动子区CpG岛的异常甲基化而表达沉默。RASSF2有3个转录本，RASSF2A是其中唯一具有相关CpG岛的转录异构体。它能以GTP依赖的方式与K－ras直接结合，具有促进凋亡和细胞周期停滞、抑制生长的作用［7］。Zhao等［13］研究发现胰腺癌中存在该基因的表达缺失，且缺失与其基因启动子区域的异常甲基化密切相关。本研究结果显示:与正常人乳腺细胞相比，乳腺癌细胞系MCF－7中RASSF2AmRNA的表达下调，进一步MSP检测发现这些癌细胞表现为RASSF2A基因启动子区异常甲基化；但经过不同浓度5－Aza－CdR处理72h后，癌细胞中该基因表达水平均出现不同程度的恢复，与其启动子区甲基化逆转的改变状况相一致，两者的变化具有剂量依赖性；提示在乳腺癌细胞中RASSF2A的表达受其基因启动子区CpG岛甲基化程度的调控，5－Aza－CdR的去甲基化处理可恢复RASSF2A的表达。

5－Aza－CdR是一种脱氧胞苷类似物，在DNA复制过程中与DNA分子相结合，并与DNA甲基转移酶1（DNMT1）形成共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，形成低甲基化子链，从而实现去甲基化功能。本研究基于文献［2，14］选用1～10μmol／L浓度的5－Aza－CdR处理乳腺癌MCF－7细胞12～96 h，结果证明5－Aza－CdR具有抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡的作用，且在一定范围内呈现剂量和时间的依赖性；结合5－Aza－CdR的去甲基化功能，说明该药主要是通过逆转基因异常甲基化导致抑癌基因重新表达来发挥抗肿瘤活性；在一定的剂量范围内，去甲基化作用越彻底，抑癌基因RASSF2A表达水平的增高越显著（图3、4），癌细胞的生长抑制也越明显（图1、2）。

总之，启动子区高甲基化导致的抑癌基因表达沉默是其功能失活的表观遗传机制。DNA甲基转移酶抑制剂5－Aza－CdR能有效逆转RASSF2A启动子区高甲基化状态导致该基因表达上调，从而促进癌细胞凋亡，在乳腺癌中RASSF2A可能是一种重要的抑癌基因。这些研究结果为乳腺癌RASSF2A的靶向治疗研究及5－Aza－CdR的临床应用提供了实验依据。

［1］ Wajed S A，Laird P W，Demeester T R.DNA methylation:an alternative pathway to cancer［J］.Ann Surg，2001，234（1）: 10－20.

［2］ Kang H F，Dai Z J，Bai H P，et al.RUNX3gene promoter demethylation by 5－Aza－CdR induces apoptosis in breast cancer MCF－7cell line［J］.Onco Targets Ther，2013，6:411－417.

［3］ Hesson L B，Wilson R，Morton D，et al.CpG island promoter hypermethylation of a novel Ras－effector gene RASSF2Ais an early event in colon carcinogenesis and correlates inversely with K－ras mutations［J］.Oncogene，2005，24（24）:3987－3994.

［4］ Zhang Z，Sun D，van Do N，et al.Inactivation of RASSF2Aby promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma［J］.Int J Cancer，2007，120（1）: 32－38.

［5］ Luo D，Ye T，Li T Q，et al.Ectopic expression of RASSF2and its prognostic role for gastric adenocarcinoma patients［J］.Exp Ther Med，2012，3（3）:391－396.

［6］ Qu Y，Dang S，Hou P.Gene methylation in gastric cancer［J］.Clin Chim Acta，2013，424:53－65.

［7］ Wu Y，Zhang X，Lin L，et al.Aberrant methylation of RASSF2Ain tumors and plasma of patients with epithelial ovarian cancer［J］.A－sian Pac J Cancer Prev，2014，15（3）:1171－1176.

［8］ Gong E Y，Smets A，Verheyen N，et al.A duplex real－time RT－PCR assay for profiling inhibitors of four dengue serotypes［J］.Methods Mol Biol，2013，1030:195－203.

［9］ Fukuda T，Sedukhina A，Ohta T.Oncogene and tumor suppressor gene［J］.Nihon Rinsho，2012，70（Suppl 7）:66－70.

［10］ Herman J G，Baylin S B.Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation［J］.N Engl J Med，2003，349（21）:2042－2054.

［11］ Jones P A，Baylin S B.The fundamental role of epigenetic events in cancer［J］.Nat Rev Genet，2002，3（6）:415－428.

［12］ 孔德光，吴高松.p53与乳腺癌转移的关系及其机制［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（6）:720－722.

［13］ Zhao L，Cui Q，Lu Z，et al.Aberrant methylation of RASSF2Ain human pancreatic ductal adenocarcinoma and its relation to clinicopathologic features［J］.Pancreas，2012，41（2）:206－211.

［14］ Xiong H，Qiu H，Zhuang L，et al.Effects of 5－Aza－CdR on the proliferation of human breast cancer cell line MCF－7and on the expression of Apaf－1gene［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29（4）:498－502.

（2014－08－27 收稿）

Effects of 5－Aza－CdR on the Proliferation of Breast Cancer Cell Line MCF－7 and the Expression of RASSF2A Gene

Ma Tengfei，Wei Da，Zhong Shanliang et al
Center of Clinical Laboratory，Jiangsu Provincial Tumor Hospital，Nanjing Medical University，210009Nanjing，China

ObjectiveTo investigate the effects of 5－Aza－2′－deoxycytidine（5－Aza－CdR）on the proliferation of MCF－7cells and the expression of RASSF2A，a tumor suppressor gene.Methods The proliferation and apoptosis of MCF－7cells were examined by using MTT and flow cytometry（FCM）after they was treated with different concentrations of 5－Aza－CdR for 12－96 h.The expression of RASSF2AmRNA was detected in MCF－7cells treated by 5－Aza－CdR for different time by real－time quantitative PCR（RT－qPCR），and the methylation status of RASSF2Awas determined using methylation－specific polymerase chain reaction（MSP）.Results The proliferation of MCF－7cells was inhibited in a dose－and time－dependent manner after treatment with 1，5，and 10μmol／L 5－Aza－CdR for 24，48，72and 96h，respectively.FCM showed the apoptosis rate was increased in MCF－7cells treated with 1，5，and 10μmol／L 5－Aza－CdR for 72h.The apoptosis rate was（25.5±3.5）%in 5μmol／L 5－Aza－CdR group and（58.2±3.2）%in 10μmol／L 5－Aza－CdR group，significantly higher than that in the control cells［（13.4± 2.0）%，P＜0.05］.RT－PCR revealed that the expression of RASSF2AmRNA was increased with the concentration of 5－Aza－CdR.Further MSP analysis demonstrated that the methylation status of RASSF2Awas reversed by 5－Aza－CdR to some degree.Conclusion 5－Aza－CdR may inhibit the proliferation of MCF－7cells by reversing the abnormal methylation status of RASSF2Aand thus up－regulating its expression.RASSF2Ais a tumor suppressor gene associated with breast cancer.

RASSF2A； DNA methylation； 5－Aza－CdR； breast cancer

R737.9

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.006

＊国家自然科学基金资助项目（No.81272470）；江苏省六大人才高峰资助项目（No.2010－WS－075）

马腾飞，男，1989年生，医学硕士，E－mail:tengfeitengfei2008＠163.com△

，Corresponding author，E－mail:jhzhao2838＠sina.com