抗菌性植物精油的复配及其微乳液的制备

郭锦棠，余前峰，黄艳翠，郁培云，张 瑾

抗菌性植物精油的复配及其微乳液的制备

郭锦棠，余前峰，黄艳翠，郁培云，张 瑾

(天津大学化工学院，天津 300072)

针对单一植物源杀菌剂存在高成本、低抗菌性且抗菌谱较窄及植物精油不稳定的问题，设计开发了一种新型的抗菌复方精油微乳液．采用协同指数法确定精油的最佳复配组合，并利用相转化法制备其微乳液，通过分析拟三元相图中微乳液区域的大小研究了表面活性剂、助表面活性剂、表面活性剂与助表面活性剂的质量比(Km)及油相含量对微乳液形成的影响．结果表明：在室温条件下，以丁香油-肉桂油-大蒜油复配精油(质量比8∶1∶8)为油相、Tween-80为表面活性剂、甘油为助表面活性剂、蒸馏水为水相，当Km＝5∶1、油相和混合表面活性剂的质量比为2∶8时，制备的微乳液抗菌性能显著，且外观及稳定性等均较好．

植物源杀菌剂；复配；微乳液；拟三元相图；抗菌性

随着生态保护意识的增强，化学合成类杀菌剂由于其高毒、高残留、高污染已不符合当前的需求．因此，寻找和开发高效、低毒的杀菌剂是现今研究的重点．植物源杀菌剂作为从天然植物中提取的有效杀菌成分，具有低毒、易分解、不易产生抗药性及对环境友好等优点[1]，近年来对其研究已屡见不鲜．由于单一植物源杀菌剂存在高成本、低抗菌性且抗菌谱较窄等弊端，故将多种抗菌植物成分进行复配，增强其抗菌效力、扩大其广谱抗菌性是非常必要的[2]．

植物抗菌活性成分，特别是精油，由于稳定性及溶解性较差且长期放置易变质而很少直接提取利用，往往是将其加工成各种制剂来提高稳定性，延长产品的杀菌效力、扩大其应用范围[3-4]．而微乳液作为一种自发形成的各向同性、透明、热力学稳定的均相分散体系，是难溶性挥发精油的良好载体，通过选择合适的表面活性剂和助表面活性剂，可将精油很好地增溶到微乳体系中，从而提高其稳定性[5-6]．

笔者主要通过选取几种抑菌性能较好的植物精油进行复配，按照协同指数法的判定标准，确定出具有协同效应的最佳复配组合，然后将其与一定比例的表面活性剂、助表面活性剂和水相混合，制备成具有杀菌效力的微乳液．利用拟三元相图筛选出最佳制备配方，并对其进行性能评价，从而得到优化的抗菌性复方精油微乳液．

1 实验部分

1.1 材料和仪器

实验材料包括：水解酪蛋白琼脂培养基MH(生化试剂)，青岛高科园海博生物科技有限公司；营养琼脂(生化试剂)，天津市光复精细化工研究所；丁香酚标准品，批号34538，＞99.5%(GC)，阿拉丁公司；大肠杆菌ATCC2592、金黄色葡萄球菌ATCC6538，中国科学微生物研究所等．

实验仪器包括：手提式蒸汽压力灭菌锅(YXQSG46-280S)，水浴恒温振荡器(SHZ-88)，磁力加热搅拌器(CL-4A)，高速台式离心机(LG16-A)，纳米粒度及Zeta电位仪(ZetasizeNano-ZS90)，紫外分光光度计(UV745型)等．

1.2 几种植物精油的抑菌效果研究

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，采用最小抑菌浓度法[7-8]测定丁香、肉桂等精油的最小抑菌浓度(MIC)，得到各自的抑菌效力，选取抑菌效果较好的精油进行复配；采用协同指数法[9-10]测定复配精油的联合抑菌效果，根据分级抑菌浓度(FIC)指数选择出抗菌性能优良的植物精油复配组合，作为抗菌性微乳液的有效成分．

1.3 抗菌性复方精油微乳液的制备

本文采用相转化法[11]制备微乳液，通过固定油相和表面活性剂的比值，再往体系中滴加水相的方法来确定微乳中各组分的含量．具体操作如下：先将表面活性剂与助表面活性剂按Km为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1混合制成混合表面活性剂(Smix)，再将复配精油和Smix按质量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1精密称量，总量为10,g，置于烧杯中，用磁力搅拌器搅拌均匀．在室温下，用5,mL微量注射器往体系中滴加蒸馏水，直至形成澄清透明的微乳液．在滴加的过程中，仔细观察体系的变化，当体系由澄清变为浑浊或由浑浊变为澄清时，记录临界加水量，从而确定微乳液的区域界限，利用拟三元相图[12]来表示微乳区域的变化，研究其处方组成，筛选出最佳制备配方．

1.4 抗菌性复方精油微乳液的性能评价

通过外观、物理性质等对微乳液进行质量评价；通过离心实验、长期实验等对微乳液进行稳定性评价；最后，采用抑菌环法[7-8]对微乳液进行抗菌性能评价．

2 结果与讨论

2.1 几种植物精油的抑菌效果研究

2.1.1 单一植物精油的抑菌效果

通过最小抑菌浓度法测得了大蒜油、丁香油、连翘油、生姜油、肉桂油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC，结果如表1所示．从表1可以看出，5种植物精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有较好的抑菌性，且抑菌效力表现为大蒜油＞肉桂油＞丁香油＞生姜油＞连翘油，选取单一抑菌效力强的大蒜、肉桂及丁香精油进行复配．

表1 单一植物精油的MICTab.1 MIC of single plant essential oil

2.1.2 植物精油的复配抑菌效果

将丁香油分别与肉桂油、大蒜油进行复配，通过最小抑菌浓度法观察复配液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制情况，计算出FIC值，并根据FIC指数来判定其复配抑菌效果，结果见表2和表3．

根据FIC指数的判定标准，由表2可以看出丁香油与肉桂油联合使用后，对大肠杆菌表现出相加作用，质量比约为8∶1，对金黄色葡萄球菌则表现出协同作用，质量比约为2∶1；由表3可知，丁香油与大蒜油联合使用后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出协同作用，质量比分别约为8∶1和1∶2，此实验结果表明丁香油与肉桂油、大蒜油复配具有较好的协同抑菌效果.

在丁香油与肉桂油、大蒜油两两复配的基础上，将三者进行复配，通过最小抑菌浓度法观察三者复配后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制情况，判断出三者复配时的抑菌效果及最佳比例，实验结果如表4与表5所示．

表2 丁香油与肉桂油复配的FIC指数Tab.2 FIC index of clove oil and cinnamon oil

表3 丁香油与大蒜油复配的FIC指数Tab.3 FIC index of clove oil and garlic oil

表4 丁香油-肉桂油和大蒜油的复配物对大肠杆菌生长的抑制效果Tab.4 Effect of compound of clove oil-cinnamon oil and garlic oil on growth of E. coli

表5 丁香油-肉桂油和大蒜油的复配物对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果Tab.5 Effect of compound of clove oil-cinnamon oil and garlic oil on growth of S. aureus

由表4和表5可以看出，丁香油、肉桂油与大蒜油三者联合使用后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出较好的抑制作用，且丁香油-肉桂油与大蒜油复配后对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1/8,MICD1∶1/2,MICC1，质量比约为8∶1∶8；对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1/4,MICD2∶1/8,MICC2，质量比约为2∶1∶4，此实验结果为抗菌性微乳液有效成分的确定提供了有力的实验依据．

2.2 抗菌性复方精油微乳液的制备

丁香油、肉桂油与大蒜油复配后具有较好的抑菌效果，但其性质不稳定、易挥发且难溶于水，故加入各类表面活性剂进行增溶形成微乳剂，提高其稳定性与溶解能力．在本文中，选用Tween-80和OP-10作为表面活性剂；以甘油、正丁醇和正戊醇作为助表面活性剂；以丁香油-肉桂油-大蒜油(8∶1∶8)复配精油作为油相；以蒸馏水作为水相，利用拟三元相图，来研究影响抗菌性微乳液形成的主要因素，筛选出最佳制备配方．

2.2.1 表面活性剂对微乳液形成的影响

室温下，在复配精油/表面活性剂/正戊醇/蒸馏水(Km＝5∶1)的微乳体系中，考察了Tween-80和OP-10两种非离子表面活性剂对微乳液形成的影响，所得拟三元相图如图1所示，图中阴影部分为O/W型微乳液区．

表面活性剂作为微乳液中不可或缺的成分，它不仅能同时吸附油相和水相，还能降低油水界面的张力，促使界面膜弯曲形成不同类型的微乳液．从图1可以看出，与OP-10相比，Tween-80形成的微乳液区域更大，这可能是由于Tween-80更易吸附到油水界面，降低界面张力，促进微乳液的形成；并且OP-10作表面活性剂制备微乳液的过程中，产生的气泡较多，静置较长的时间气泡才消失．故选择Tween-80作为本研究的表面活性剂．

图1 表面活性剂对微乳体系形成的影响Fig.1 Effect of different surfactants on formation of micro-emulsion system

2.2.2 助表面活性剂对微乳液形成的影响

室温下，在复配精油/Tween-80/助表面活性剂/蒸馏水(Km＝5∶1)微乳体系中，考察了助表面活性剂甘油、正丁醇和正戊醇对其形成的影响，图2为所得拟三元相图，图中阴影部分为O/W型微乳液区．

由图2可以看出不同助表面活性剂形成的微乳区大小顺序为：甘油＞正丁醇＞正戊醇，甘油体系形成的微乳区域较大，这可能是由于甘油的链段较短，能有效地避免微乳液制备过程中黏稠态的产生，有利于微乳液体系的形成，并且与其他助表面活性剂相比，甘油分子更易插入到界面膜的表面活性剂中，降低界面膜的表面张力，增加体系的流动性和稳定性，从而使界面膜扩张和弯曲形成微乳液．

2.2.3 Km对微乳液形成的影响

室温下，在复配精油/Tween-80/甘油/蒸馏水微乳体系中，考察了Km对其形成的影响，所得拟三元相图见图3，图中阴影部分为O/W型微乳液区．

在合适的Km值时，表面活性剂与助表面活性剂能很好地吸附于界面膜上，促进微乳液的形成．从图3可以看出不同Km值条件下形成的微乳液区域大小排列顺序为：5∶1＞6∶1＞4∶1＞3∶1＞2∶1，在一定范围内，微乳液区域随Km的增大表现出较明显的增大趋势，当Km＝5∶1时，形成的微乳液区域最大，此后再增大Km，微乳液区域不发生明显变化，这可能是由于在此比例条件下助表面活性剂分子能更好地进入到表面活性剂分子中，调节体系的表面张力及膜的流动性和稳定性，形成更大的增溶空间，增大了微乳液区域.

图2 助表面活性剂对微乳体系形成的影响Fig.2Effect of different co-surfactants on formation of micro-emulsion system

图3 Km对微乳体系形成的影响Fig.3 Effect of different Kmon formation of micro-emulsion system

2.2.4 油相含量对微乳液形成的影响

本文将油相与混合表面活性剂按一定比例加入到体系中，对油相含量的考察将影响到微乳液的杀菌性能．通过上述大量实验表明，复方精油/ Tween-80/甘油/蒸馏水微乳体系在油相和混合表面活性剂的比例为1∶9、2∶8和3∶7时都能形成微乳液，但是比例为3∶7时体系较不稳定，为了增溶更多的精油来提高微乳液的杀菌性能，故选择油相和混合表面活性剂比例为2∶8来制备微乳液．

通过对微乳液形成过程中主要因素的考察，确定的抗菌性微乳液的最优制备配方如下：在室温下，以Tween-80为表面活性剂，甘油为助表面活性剂，蒸馏水为水相，丁香油-肉桂油-大蒜油(8∶1∶8)为油相，当Km＝5∶1及油相和混合表面活性剂的质量比为2∶8(总质量为10,g)时可制备性能较好的微乳液，且此时微乳中所含的有效成分浓度大于最低抑菌浓度，保证了微乳液的杀菌效果．

2.3 抗菌性复方精油微乳液的性能评价

采用最优条件制备出不同批次的微乳液，并对其进行质量、稳定性及抗菌性能评价．

2.3.1 质量评价

由肉眼观察到制备出的抗菌性微乳液为淡黄色、澄清透明、均一的液体，并且用蒸馏水稀释后会出现淡蓝色的乳光，该微乳液的物理性质测试结果如表6所示．从表6可以看出该微乳液的粒径小于100,nm，黏度适中，pH值偏酸性，符合抗菌剂的质量要求．

表6 微乳液的物理性质Tab.6 Physical properties of micro-emulsion

2.3.2 稳定性评价

本文以丁香酚为研究对象，考察了抗菌性微乳液中有效成分的储存稳定性．

用紫外分光光度计测定不同质量浓度的丁香酚标准品在287,nm处的吸光度，并以质量浓度(ρ)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制丁香酚标准曲线，如图4所示，标准曲线方程为A＝0.011,76,ρ＋ 0.042,75，R＝0.996,2，并且在10～95,µg/mL质量浓度范围内，线性关系良好．

图4 丁香酚的紫外标准曲线Fig.4 UV standard curve of eugenol

选取3批微乳样品，将其稀释1,000倍后于287,nm处测定其吸光度，由标准曲线计算出对应的丁香酚质量浓度，结果如表7所示，由表7可知原微乳样品中丁香酚的平均质量浓度为25.04,mg/mL．

表7 丁香酚初始质量浓度测定结果Tab.7 Initial mass concentration of eugenol

将所选取的3批抗菌性微乳液放置在室温下，并定期进行取样观察和测试，实验结果见表8．由表8可以看出，在实验时间内，微乳液的外观未发生明显的变化，均为澄清透明的液体，且没有出现分层破乳的现象，微乳液的pH值及丁香酚的含量随着储存时间的延长略有下降，但并未出现大幅度的变化，表明该体系具有较好的稳定性．

表8 抗菌性复方微乳液的稳定性实验结果Tab.8 Results of stability experiment of antimicrobial compound micro-emulsion

2.3.3 抗菌性评价

采用抑菌圈法测定微乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性，结果见表9．抑菌圈直径＜7,mm，药物对细菌无抑制作用；抑菌圈直径＞7,mm，药物对细菌有抑制作用，且直径越大，抑制作用越强.

从表9可以看出，抗菌性复方微乳液和精油混合液的抑菌圈直径均大于20,mm，表明两者对实验菌具有很好的抑制作用，并且抗菌性微乳液的杀菌性能与相同浓度条件下的纯复配精油的杀菌性能相差较小，而未加精油的微乳液抑菌圈直径小于7,mm，说明将挥发性精油加工成微乳液的剂型是可行的，既保证了挥发精油的储存稳定性，又保持了具有抑菌性能的挥发精油的药效．

表9 复方微乳液的抗菌活性结果Tab.9 Antibacterial activity of compound micro-emulsion

3 结 论

(1)丁香油、肉桂油与大蒜油均具有较好的杀菌性能，且三者复配使用能够发挥出协同抑菌效果，最佳配伍质量比为8∶1∶8．

(2)抗菌性微乳液的最优配方是：在室温条件下，以Tween-80为表面活性剂，甘油为助表面活性剂，蒸馏水为水相，丁香油-肉桂油-大蒜油复配精油(质量比8∶1∶8)为油相，当Km＝5∶1及油相和混合表面活性剂的质量比为2∶8时，制备的微乳液质量较好，且体系中所含的精油量较大，保证了微乳液的杀菌效果．

(3)最优配方下制备的微乳液为淡黄色、澄清透明的均一液体，黏度适中，pH值偏酸性，粒径较小，丁香酚的平均质量浓度为25.04,mg/mL，且具有较好的稳定性，同时微乳液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均大于20,mm，具有很好的抑菌性能．

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（责任编辑：田 军）

Compounding of Antibacterial Plant Essential Oil and Preparation of Its Micro-Emulsion

Guo Jintang，Yu Qianfeng，Huang Yancui，Yu Peiyun，Zhang Jin
(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

In order to overcome the high cost，low antimicrobial activity，and narrow antibacterial spectrum of single botanical fungicide as well as instability of plant essential oils，a new antimicrobial micro-emulsion containing compound essential oils was designed and developed. The optimal compound ratio of essential oils was determined using the synergy index method，and its micro-emulsion was prepared by phase inversion method. The influences of surfactant，co-surfactant，mass ratio(Km) of surfactant to co-surfactant，and content of oil phase on the microemulsion formation were investigated through analyzing the micro-emulsion area of pseudo ternary phase diagram. The results show that the oil phase was composed mainly of clove oil，cinnamon oil and garlic oil with the mass ratio of 8∶1∶8，and the water phase was distilled water. The surfactant and co-surfactant were Tween-80 and glycerol，respectively. When Kmwas 5∶1 and the mass ratio of oil phase to mixed surfactants was 2∶8，the antibacterial microemulsion could achieve the maximum activity as well as exhibit a good appearance and stability at room temperature.

botanical fungicide；compounding；micro-emulsion；pseudo ternary phase diagram；antibacterial

S482.2

A

0493-2137(2015)05-0415-07

10.11784/tdxbz201403014

2014-03-06；

2014-04-09.

郭锦棠（1968— ），女，博士，教授.

郭锦棠，jtguo@tju.edu.cn.