产α蒎烯重组大肠杆菌发酵培养基优化

任 萌,高国富,咸 漠,杨建明,3

(1.南京农业大学生命科学学院,江苏南京 210095；2.中国科学院生物基材料重点实验室,中国科学院青岛生物能源与过程研究所,山东青岛 266101;3.青岛农业大学生命科学学院,山东青岛 266109)

任 萌1,2,高国富1,*,咸 漠2,杨建明2,3

(1.南京农业大学生命科学学院,江苏南京 210095；2.中国科学院生物基材料重点实验室,中国科学院青岛生物能源与过程研究所,山东青岛 266101;3.青岛农业大学生命科学学院,山东青岛 266109)

为了提高α-蒎烯的产量,对YJM28菌株的发酵培养基进行了响应面优化。通过单因素实验筛选出了适合发酵α-蒎烯的最佳碳、氮源,分别为葡萄糖和蛋白胨。利用Design-Expert软件设计Plackett-Burman实验方案筛选出了影响α-蒎烯产量的3个重要因子；通过中心组和实验及响应面分析法确定了3个因子的最佳浓度:微量元素溶液63.78μL/100mL,蛋白胨9g/L,葡萄糖2.77g/L。用优化后的培养基发酵产α-蒎烯,48h后的α-蒎烯产量达33.26mg/L,比优化前提高了6.75倍。

α-蒎烯,培养基优化,响应面,重组大肠杆菌

α-蒎烯主要存在于松木中,作为松树分泌物的一种化学物质,对松树病虫防治有重要作用。α-蒎烯(2,6,6-三甲基双环(3.1.1)-2-庚-2-烯)是萜烯类物质的衍生物,广泛用于香料合成,润滑剂及航空燃料等领域[1-4]。目前α-蒎烯工业生产主要来源于松节油馏分[3]。然而森林资源总量有限,原料短缺成为α-蒎烯工业化生产的瓶颈。因此,寻找新的可再生替代来源显得日益重要,其中利用微生物转化获得α-蒎烯是极具吸引力的新途径[4]。响应面法作为一种传统的统计学方法[5],其作用是能够行之有效的优化生物过程,获得生物过程的最佳条件[6],近年来已经被广泛应用到生物、医药、农业等领域[7-8]。2013年,杨建明等人成功构建了可以合成α-蒎烯的重组大肠杆菌[9],之后,Pamela Peralta-Yahya和她的研究团队将来自6种植物,而且是最活跃的两个蛋白基因(GPPS和PS)克隆到大肠杆菌中,使其可通过自身代谢并最终转换成蒎烯,可获得28mg/L的蒎烯产量[10]。

本文用重组大肠杆菌YJM28作为生产菌种,通过系统的优化培养基大幅度增加了产量为实现α-蒎烯的工业化应用提供了支持。从发酵培养基优化角度提高重组大肠杆菌生产α-蒎烯产量在国内相关文献中至今报道较少。

表2 基于CCD的响应面实验设计变量水平Table 2 Experimental range and levels of the independent variables in RSM based CCD

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

重组E.coliYJM28,由质粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-pt30和pTRC-low(含有片段IDI 1、ERG 8、ERG 12、ERG 19)共转获得,中科院青岛生物能源与过程研究所,生物基化学品团队实验室构建及保存；种子培养基 蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,氨苄青霉素100mg/L,霉霉素34mg/L；

初始发酵培养基 葡萄糖2g/L,牛肉粉9g/L,三水合磷酸氢二钾 9.8g/L,一水合柠檬酸6.3g/L,柠檬酸铁铵0.3g/L,硫酸镁溶液 2mmol/L；发酵培养基 用时添加34mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素。

Cary-50紫外-可见分光光度计 美国瓦里安技术有限公司；SP-6890气相色谱仪 山东鲁南瑞红化学分析仪器有限公司；IS-RDS3型恒温振荡器 美国CRYSTAL公司；1-14台式高速离心机 美国Sigma公司。

1.2 培养基优化方法

1.2.1 培养方法 挑取单克隆于3mL LB培养液,37℃,180r/min摇床培养8～12h后,1mL种子培养基接入装有100mL发酵培养基的590mL厌氧瓶中,37℃,180r/min培养至 OD600达到0.6～0.9,加入IPTG溶液诱导,诱导后培养温度调至30℃,发酵48h[11]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 氮源实验 以初始发酵培养基为基础,分别添加相同质量浓度(9g/L)的牛肉粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、尿素作为氮源进行α-蒎烯发酵实验,条件如1.2.1,发酵后48h测定α-蒎烯浓度。

1.2.2.2 碳源实验 分别用相同质量浓度(2g/L)的蔗糖、木糖、果糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、乙酸钠和葡萄糖作为碳源进行发酵实验,条件如1.2.1,发酵后48h测定α-蒎烯浓度。

1.2.3 P-B实验 Plackett-Burman实验设计法,是两水平部分因子实验,用最少的实验次数估计出因素的主次,以从众多的考察因素中快速有效的筛选出最为重要的因素进行下一步研究。根据之前的实验结果设计P-B实验,实验次数N=15,以48h后产物α-蒎烯浓度为响应值。因素及水平表见表1,实验设计矩阵见表3。

1.2.4 响应面分析 采用Central-Composition法[14]。依据Central-Composition中心旋转设计原理,设计三因素五水平的响应面分析实验[8]。实验设计矩阵中包含三类实验点,析因点、零点以及星点。析因点由自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维定点,共8组；零点用来估计实验误差用,由区域的中心点构成,共6组；星点用于校正拟合曲面,使之能更好的对实验数据进行三维拟合,从而得到拟合方程,共8组[15-16]。因素水平表见表2,实验设计矩阵见表3,非显著因素选择水平根据P-B实验结果确定,效应为正,则选择高浓度,反之,则选择低浓度。

表1 P-B实验设计因素水平表Table 1 Levels of variables for Packett-Burman experiment

1.2.5 α-蒎烯检测及菌浓测定 发酵结束将摇瓶放入60℃控温箱处理30min,顶空抽取1mL气体进行气相色谱检测,以α-蒎烯标准品作为定量标准。使用SP-6890气相色谱仪,色谱柱为HP-Innowax色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm),检测器为火焰离子化检测器;气化室温度200℃,柱室温度50℃保温0.5min,然后4℃/min升温至70℃,再以20℃/min升温至250℃,保温5min,检测器温度200℃[12-13]。用分光光度计在600nm波长测定菌体浓度。

2 结果与分析

2.1 氮源筛选结果

氮源筛选结果如图1。

图1 氮源筛选结果图,横坐标表示不同的氮源, 纵坐标代表产物的气相峰面积Fig.1 Result of screening nitrogen source注:1,2,3,4,5,6,7,8分别代表奥博酵母粉、MD牛肉粉、 Solarbio牛肉膏、国药大豆蛋白胨、大茂蛋白胨、 氯化铵(国药)、硫酸铵(国药)、尿素(国药)。

根据图1的实验结果,在五种有机氮源和三种无机氮源中蛋白胨是优选的氮源。正如图1所示,有机氮源效果明显要比无机氮源好很多。48h内,无机氮源没有产物α-蒎烯的累积；有机氮源中,蛋白胨的发酵效果明显优于其他组。在发酵的菌体生长阶段,蛋白胨实验组菌浓达到诱导要求所需的培养时间大约3h,而酵母粉和牛肉粉实验组大约4h,缩短约1h。在发酵后期,蛋白胨组菌体正常,不发生自溶；酵母粉和牛肉粉实验组后期发酵液当中黏度增大,细胞形态拉长,造成菌体生长异常。因此选用蛋白胨作为优选氮源进行下一步实验。

2.2 碳源筛选结果

将蛋白胨作为氮源,葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等8种作为待选碳源进行筛选,筛选结果如图2所示。

图2 碳源筛选结果Fig.2 Result of screening carbon source注:1,2,3,4,5,6,7,8分别代表蔗糖、木糖、果糖、 麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、乙酸钠和葡萄糖。

根据图2所知,葡萄糖作为α-蒎烯发酵的碳源较好。对产物提高贡献大小依次为:葡萄糖>麦芽糖>甘油、乙酸钠、淀粉>蔗糖、木糖和果糖。麦芽糖、蔗糖作为二糖,微生物不能直接利用,需要水解为单糖后为微生物利用。葡萄糖组在发酵前期菌体生长速率正常,能够保证在后期菌体能够合成产物α-蒎烯,发酵液粘度正常,细胞形态也没有出现异常,发酵后期没有发生菌体自溶,说明葡萄糖实验组是首选的碳源。麦芽糖组前发酵期出现发酵液发粘,培养基当中传质速率下降,菌体生长困难。乙酸钠是一种强碱弱酸盐,在水中能分解出少量乙酸,抑制微生物的生长,用它作为微生物发酵的碳源,实验组从接菌到诱导的时间由原来的3h左右提高到7h左右,增加了菌体的发酵周期。其他候选组对α-蒎烯的产物合成提高贡献不大,因此暂时不考虑。综上所述,将葡萄糖作为优选后的碳源进行后续的单因素及正交实验。

2.3 P-B实验结果

P-B实验采用N=15的实验设计表,对8个因素进行考察,每个因素各选取高低两个水平,以发酵结束后α-蒎烯的气相色谱峰面积作为响应值,实验设计及结果见表3,P-B实验结果的回归分析见表4。

表3 P-B实验设计及结果Table 3 Design and result of P-B experiment

表4 P-B实验设计因素水平及效应分析Table 4 Analysis of the effect for Packett-Burman experiment

注：R2=0.9196；调整R2=0.9107；**表示在α=0.01水平上对结果影响显著的重要因素；*表示在α=0.05水平上对结果影响显著的重要因素；其他是在α=0.05水平上对结果影响不显著的非重要因素。

利用Design-Expert对表3中的结果建立多元一次回归模型,分析结果见表4。由表4可知,所建立的模型p值是0.0222,说明模型有2.22%的可能性被噪声影响,该模型结果可靠。实验因素葡萄糖、蛋白胨、微量元素溶液的p值分别是0.0037、0.0416、0.0223,均小于0.05,其他因素的p值大于0.05,因此,葡萄糖、蛋白胨、微量元素溶液对产物产量影响显著。8种因素对响应值有正效应的有:葡萄糖、硫酸镁溶液、微量元素溶液、IPTG溶液；对响应值有负效应的有:蛋白胨、柠檬酸铁铵、磷酸氢二钾、柠檬酸。所以,要想增加α-蒎烯产量,需要增加正效应因素的浓度,反之,则需要减少。

2.4 关键培养基浓度的最优化

由单因素实验确定显著及非显著因素的水平,再采用中心组合设计实验对葡萄糖、蛋白胨以及微量元素溶液这3个因素进行基于CCD实验设计的响应面分析,实验结果见表5。

表5 中心组合设计矩阵及实验结果Table 5 Design and results of central composition design

表6 中心组合设计二次回归模型方差分析及回归分析Table 6 Regression Analysis and ANOVA for the quadratic regression model obtained from CCD

注：R2=0.9268；**表示在α=0.05水平上对结果影响显著的重要因素；*表示在α=0.05水平上对结果影响显著的重要因素；其他是在α=0.05水平上对结果影响不显著的非重要因素。 利用Design-Expert 软件对实验数据进行多元回归分析,三元二次回归拟合方程如下:Y=25502.71+4653.314A+5890.257B+256.4958C+5486.009AB-156.934AC+256.7286BC-6562.79A2-4917.23B2-5768.86C2

其中,Y是产物α-蒎烯的气相峰面积；A,B和C分别代表葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液浓度。

对以上方程进行回归分析,分析结果见表6。通过表6知,三种显著因素对产物产量的影响大小顺序依次是:蛋白胨>葡萄糖>微量元素溶液。所建立模型的p=0.0098<0.01,说明此模型在α=0.01水平差异显著。模型失拟项p=0.9533>0.5,说明模型的选择比较恰当；相关系数R2=0.9268>0.9,说明拟合良好。以上表明,选择的模型能够对α-蒎烯的发酵优化实验进行较为精确的预测和分析。

对实验结果用Design-Expert7.0软件分析,分析结果见表6。

利用Design-Expert对表5的数据进行曲面拟合,结果见图3。拟合后形成的曲面分为三类,一种是“凸”形图,该种图形的康托尔图是等高线图,存在极大值点；还有一种是“凹”形图,该种图形的康托尔图也是等高线图,存在极小值点；最后一种是“马鞍”形,该图的康托尔图是双曲线形,不存在极值点。通过图3可知,葡萄糖和蛋白胨交互作用显著,葡萄糖和微量元素溶液添加量、蛋白胨和微量元素溶液添加量交互作用不显著。采用软件对拟合图形进行分析可知,三张曲面图都是“凸”形图,存在极大值点,说明建立模型的拟合方程存在稳定点(极大值点)[17]。对模型进行岭嵴分析[18](ridge analysis),得到极大值点所对应因素的预测值分别是:葡萄糖,蛋白胨和微量元素溶液各个用量为2.77,9g/L,63.78μL/100mL,此时方程存在极大值点,预测响应值是30553.22,依据线性方程Y=44.721X+36.779(Y代表产物气相峰面积,X代表产物浓度,单位μg/L),所对应α-蒎烯浓度是33.44mg/L。

图3 葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液响应面分析曲面图Fig.3 The response surface plot and contour plots for the effects of glucose(A)and peptone(B) and trace element solution(C)

2.5 验证实验

为了验证回归模型的可信性,用上述的优化条件进行菌株YJM28产α-蒎烯的发酵实验,3次重复,所得α-蒎烯的产量分别为33.58、31.84、34.36mg/L,3次重复的平均值为33.26mg/L。实验值与模型的预测值基本一致,可见该模型能较好的预测实际发酵产α-蒎烯的情况。通过培养基组分优化,菌株YJM28发酵α-蒎烯产量从4.28mg/L提升至33.26mg/L,提高了6.75倍。

3 结论与讨论

通过实验筛选出了对重组工程大肠杆菌培养基优化起重要作用的葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液三种组分,并确定了最佳浓度。最终确定培养基的最佳配比是:葡萄糖 2.77g/L,蛋白胨 9g/L,微量元素溶液 63.78μL/100mL,IPTG浓度 0.04mmol/L,柠檬酸铁铵 0.15g/L,MgSO4溶液 8mmol/L,三水合磷酸氢二钾 4.9g/L,一水合柠檬酸 0.525g/L,α-蒎烯产量从4.28mg/L提高到33.26mg/L,与初始的发酵培养基相比提高了675.21%。

本研究对重组大肠杆菌YJM28的发酵培养基进行了优化。利用单因素实验确定了葡萄糖、蛋白胨以及微量元素溶液添加量对α-蒎烯的产物浓度有重要影响。葡萄糖作为有机碳源,增加用量一方面能够增加菌体生长速度,增加产物合成速度；另一方面,随着葡萄糖用量的增加,培养基的粘度增大,传质速率下降,造成发酵液当中的溶氧降低,阻碍了菌体的生长。蛋白胨作为有机氮源,增加用量一方面促进菌体生长,增加产物合成；另一方面,在产物合成后期,菌体生长过盛,造成发酵液黏度增高,溶氧降低,反而抑制了菌体生长,造成菌体提前衰老,菌体发生自溶。微量元素溶液是由锰、锌、铜、铁、钴等微量元素的水合盐配制成的盐溶液,含有多种菌体生长所必须的金属元素。微生物当中的酶,其活性中心都含有金属元素的催化中心,增加金属元素的含量,能够迅速增加酶的活性,使酶的活性得到成倍提高,从而提高了产物的合成速率。另一方面,增加微量元素溶液的用量,提高了铜、锌等金属元素在发酵液当中的浓度,对菌体细胞造成了一定的毒性,使菌体发生生长延滞甚至停止生长。因此,从对细胞生长及产物合成的重要性来讲,微量元素溶液对细胞生长重要,但是用量对菌体产物合成影响不是很大,而蛋白胨和葡萄糖则是菌体生长所必须的碳、氮源,增加用量,则能够快速的促进产物合成以及细胞的增长,这与通过回归模型的分析得到的结论相吻合。

本文报道从培养基优化的角度提高了重组工程大肠杆菌产α-蒎烯的产量,对后续放大以及大规模生产提供了一定的理论依据。

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Optimization of medium for the production of α-pineneby the recombinantEscherichiacoli

REN Meng1,2,GAO Guo-fu1,*,XIAN Mo2,YANG Jian-ming2,3

(1.School of Life and Sciences,Nan Jing Agricultural University,Nanjing 210095,China；2.CAS Key Laboratory of Bio-based Material,Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China;3.School of Life and Sciences,Qing Dao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

In order to improve the yield of alpha-pinene,optimization of the fermentation medium for strain YJM28 was carried out by response surface analysis. The optimal carbon and nitrogen source for YJM28 were glucose and peptone,respectively. Three most important substrates for YJM28 were screened via Plackett-Burman experiments and using Design-Expert software. Optimal concentrations of the three substrates were confirmed by Central-Composed design and response surface analysis. The results were 63.78μL/100mL of trace element solution,2.77g/L of glucose and 9g/L of peptone. Fermented with the optimized medium,the yield of alpha-pinene after 48h reached 33.26mg/L,increased by 6.75-fold compared with the original medium.

α-pinene;medium optimization;response surface;recombinantE.coli

2014-03-06

任萌(1988-)，男，硕士研究生，研究方向：发酵工程。

*通讯作者:高国富(1963-)，男，硕士，副教授，研究方向：动物活性物质、动物资源。

国家自然科学基金(21206185；21376255)；国家高技术研究发展计划(SS2013AA050703-2)；国家科技支撑计划重大项目(2012BAD32B06-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0151-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.023