柚提取物含量测定及其抗氧化、抑菌活性研究

2015-06-05 09:51姜媛媛
食品工业科技 2015年3期
关键词:柚皮果胶精油

张 芳,姜媛媛,杨 洋,张 利

(四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安 625014)

柚提取物含量测定及其抗氧化、抑菌活性研究

张 芳,姜媛媛,杨 洋,张 利*

(四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安 625014)

采用水蒸气蒸馏法、超声波辅助溶剂萃取法以及酸提醇沉法分别提取柚叶、柚皮、柚肉、柚籽中精油、总黄酮和果胶,采用气相色谱-质谱(GC-MS)、NaNO2-Al(NO3)3法和咔唑-硫酸法分别对精油成分和总黄酮、果胶含量进行分析。通过精油、总黄酮和果胶的总还原力及清除1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)能力的测定实验评价其抗氧化活性,通过滤纸片扩散法评价其抑菌活性。结果表明:柚皮中精油和总黄酮含量最高;柚肉中果胶含量最高;柚皮精油共鉴定出25种化合物,其主要成分为D-柠檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%)和β-蒎烯(2.14%);柚三种活性成分(精油,总黄酮和果胶)均具有较强的还原力,对DPPH·的IC50(清除率达到50%时的浓度)分别为1.53%、0.07%和0.21%,表现出较强的抗氧化活性;对3种受试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌)均有抑制活性,且随着物质浓度的增加,对受试菌的抑菌效果逐渐增强。该研究结果为柚资源的合理开发和回收再利用以及生物杀菌剂、天然食品抗氧化剂和防腐剂的开发提供了理论依据。

柚,精油,总黄酮,果胶,抗氧化活性,抑菌活性

柚(Citrusmaxima)为芸香科常绿果树,在我国广东、四川等地均有栽培[1]。柚皮可提取精油、果胶、柚皮甙和新橙皮甙等[2]。其中,柚皮香精油是饮料、啤酒、糖果的矫味剂和赋香剂;柚皮甙、芦丁等黄酮类化合物具有抗氧化活性作用,可以降低血液黏稠度,预防脑血管疾病。柚籽中也存在相当数量的黄酮类化合物,在其甘油提取物中黄酮类化合物含量高达6700mg/kg[3]。已有研究结果表明,葡萄柚果皮内含有葡萄柚果胶,且果胶有明显降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白的作用[4]。然而在实际生产中大量的柚叶、柚皮(约占柚质量的30%)和柚籽并没有得到充分利用,造成严重的资源浪费和环境污染。本实验以雅安地区的柚为研究材料,分别对柚叶、柚皮、柚肉和柚籽中的精油、总黄酮和果胶进行提取和含量测定,并研究其抗氧化和抑菌活性,旨在为柚的合理开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑麻柚 购于雅安市;无水硫酸钠、氯化钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、芦丁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、盐酸、咔唑、硫酸均为分析纯;磷酸盐缓冲液(PBS)、D-半乳糖醛酸、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)(生化试剂) 美国Sigma公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonellai) 来源于四川农业大学生命科学与理学院。实验用水均为超纯水。

UV-3200PC紫外/可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪 美国惠普公司;R200D电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;80-1电动离心机 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;KQ-3200B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;KQ-300GDV恒温数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;DZ-2BC真空干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;HH.S11-Ni6电热恒温水浴锅 北京长安永创科学仪器有限公司;ZDHW调温电热套 北京中兴伟业仪器有限公司;LDZX-40SAI立体式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;实验室专用超纯水机(Water Purifier) 四川沃特尔科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 活性成分的提取 精油的提取:称取500g粉碎后的材料,置于烧瓶中,加水浸泡2h后进行水蒸气蒸馏提取。所得挥发油用无水硫酸钠干燥,-20℃黑暗保存备用[5-6]。

总黄酮的提取:称取5g粉碎后的材料,按固液比1∶16(w/v)加入70%的乙醇,置于烧瓶中,于240W,40℃超声提取30min,提取液于35℃旋转蒸发,定容至10mL,备用[7]。

果胶的提取:称取5g粉碎后的材料,按固液比1∶20(w/v)加入超纯水,置于烧杯中,并用盐酸调节pH至2,95℃搅拌100min,旋转蒸发至原体积的1/3后加入2倍体积的无水乙醇,4℃下静止一夜,45℃真空冷冻干燥,备用[8-9]。

1.2.2 活性成分含量的测定

1.2.2.1 精油化学成份的GC-MS分析 气相色谱条件:色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)弹性石英毛细管柱。升温程序:初始温度50℃,以5℃/min升至250℃,保持45min;汽化温度325℃;进样量0.5μL;载气(He)流速1mL/min;分流流量20mL/min;分流比20∶1;溶剂延迟5min。质谱条件:电子轰击(EI)离子源;离子源温度230℃;电子能量70eV;扫描范围40~550m/z。采用Wiley谱库和NIST谱库进行检索,以面积归一法计算相对含量。

1.2.2.2 总黄酮含量的测定 总黄酮含量的测定方法参照文献[10-11]并稍做修改。配制不同浓度的芦丁标准液,分别取1mL不同浓度的芦丁标准液于试管中,向试管中分别加入0.5mL 5%亚硝酸钠溶液,震荡混匀,放置6min,加入0.5mL 10%硝酸铝溶液,摇匀后放置6min,加入4mL 4%氢氧化钠溶液,摇匀,静置20min。以70%乙醇代替样品作为空白对照。于510nm波长处测定吸光度,以质量浓度为横坐标(x),吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线。

按照上述方法测定样品吸光度,每个样品浓度梯度平行实验3次,取其平均值。通过标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。

1.2.2.3 果胶含量的测定 果胶含量的测定方法参照文献[12]并稍做修改。配制不同浓度的D-半乳糖醛酸标准液,分别取1mL不同浓度的稀释液于试管中,加5mL浓硫酸,立即摇匀,85℃水浴8min,取出冷却,再分别加入0.5mL 0.15%咔唑无水乙醇溶液,85℃水浴8min,室温暗处放置30min。以超纯水代替样品作为空白对照,于530nm波长处测定吸光度,以质量浓度为横坐标(x),吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线。

按照上述方法测定样品吸光度,每个样品浓度梯度平行实验3次,取其平均值。通过标准曲线回归方程计算样品中果胶含量。

1.2.3 抗氧化活性研究

1.2.3.1 还原力的测定 参照文献[13-14],对样品的还原力进行测定。分别取2.5mL不同浓度样品溶液,加入2.5mL PBS(0.2mol/L,pH为6.60),2.5mL 1.0%的铁氰化钾溶液,混合均匀后将该体系置于50℃水浴20min,加入10%三氯乙酸溶液2.5mL,混匀后3000r/min离心10min,移取上清液5mL,加入4mL超纯水,1mL 0.1%的三氯化铁溶液混匀。用超纯水代替样品溶液作为空白对照,10min后于700nm处测定吸光度。每个样品浓度梯度平行实验3次,取其平均值。

1.2.3.2 DPPH·清除能力的测定 参照文献[15],测定样品对DPPH·清除能力。分别取2mL不同浓度样品溶液,加入2mL 0.1mmol/L的DPPH·溶液,混匀后室温避光反应30min后,517nm波长处测吸光度。用VC代替样品溶液作为对照,超纯水代替DPPH·溶液为样品空白。每个样品浓度梯度平行实验3次,取其平均值。

DPPH·清除活性(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0:2mL DPPH+2mL无水乙醇的吸光度;A1:2mL DPPH+2mL样品的吸光度;A2:2mL无水乙醇+2mL样品的吸光度。

1.2.4 抑菌活性研究

1.2.4.1 培养基的制备 配制牛肉膏蛋白胨培养基,备用[16]。

1.2.4.2 菌悬液的制备 将各菌种活化,制成菌悬液。采用平板计数法调至浓度为含菌体106~107CFU/mL的菌悬液,备用[17]。

1.2.4.3 滤纸片扩散法测定抑菌圈 配制一定浓度的受试物溶液,参照文献[18]选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径,每种菌设置3个平行,结果取其平均值。

1.3 数据处理

数据统计分析采用SPSS20.0软件进行,绘图采用Origin 8.0软件进行。数值表示为平均值±SD。

2 结果与分析

2.1 柚不同部位活性成分的含量测定

总黄酮含量测定标准曲线线性回归方程为:y=1.8027x-0.0008,相关系数R2为0.9998,式中:y为吸光度,x为芦丁质量浓度(mg/mL)。果胶含量测定标准曲线线性回归方程为:y=0.0066x+0.1288,相关系数R2为0.9996,式中:y为吸光度,x为D-半乳糖醛酸质量浓度(mg/mL)。

柚不同部位精油、总黄酮和果胶含量测定结果如表1所示。由表1可知,柚皮中精油和总黄酮含量最高,分别为0.69%±0.10%和0.61%±0.04%。但雅安地区的桑麻柚皮中总黄酮的含量仍低于杨转琴等[19]研究的沙田柚皮中总黄酮含量。柚叶、柚籽和柚肉未检出精油。柚肉中果胶含量最高,为3.46%±0.28%,是柚皮中果胶含量的1.10倍,且柚肉和柚皮中果胶含量具有显著性差异(p<0.05)。因此,可根据需要对不同部位活性物质的含量进行提取,使之得到充分合理的利用,避免丢弃造成的资源浪费和环境污染。

表1 柚不同部位精油、总黄酮和果胶含量Table 1 The contents of essential oils,flavonoids and pectin in different parts of pomelo

注:“-”表示精油含量未检出;同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05),不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。

2.2 精油化学成分的GC-MS分析

利用GC-MS联用仪对柚皮精油进行成分分析,共鉴定出25种化合物,占总组分的99.24%,各化合物的保留时间、相对百分含量见表2。

在已鉴定的柚皮精油成分中,烯类成分9个,占94.60%;醇类成分9个,占3.12%;醛类成分4个,占1.1%;其他成分3个。主要成分为D-柠檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%),β-蒎烯(2.14%),芳樟醇(0.77%),顺-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇(0.58%),p-薄荷-1-烯-8-醇(0.47%)。D-柠檬烯是一种单萜类化合物,是食品、饮料等的调香剂,也是医药、化妆品的重要原料,在家庭日化、工业洗涤剂、油漆涂料、纺织印染等行业中有广泛的用途[20]。β-月桂烯可用于古龙香水和消除剂[21];β-蒎烯用作各种萜烯类合成香料的起始原料[22]。因此,柚皮精油可用于食品、药品以及化妆品行业中,从而使废弃的柚皮可以得到充分合理的应用。

2.3 柚活性成分的抗氧化活性研究

根据活性物质含量比较结果,以柚皮为原材料提取精油和总黄酮,以柚肉为原材料提取果胶,分别对柚精油、总黄酮和果胶进行抗氧化和抑菌活性研究。

柚皮精油、总黄酮和柚肉果胶的抗氧化活性研究结果分别如图1~图3所示。研究结果表明,柚皮精油、总黄酮和柚肉果胶均表现出较强的抗氧化活性,对DPPH·的IC50值分别为1.53%,0.07%和0.21%。

图1 精油还原力及对DPPH·的清除能力Fig.1 Reducing power and scavenging effects on DPPH· of essential oil

图 2 总黄酮还原力及对DPPH·的清除能力Fig.2 Reducing power and scavenging effects on DPPH· of flavonoids

在1%~8%浓度范围内,精油还原力与精油浓度呈现明显的量效关系。当精油浓度为8%时,吸光度为0.996,表现出较强的还原力。在1%~8%范围内,精油对DPPH·均有清除作用,且在1%~4%范围内,随着精油浓度的增加,对DPPH·的清除能力逐渐增强;4%~8%范围内,随精油浓度的增加对DPPH·的清除能力趋于平缓。当浓度为8%时,精油对DPPH·的清除率达到94.68%。

表2 柚皮精油的化学成分分析结果Table 2 Analysis results of chemical composition of pomelo peel essential oil

图3 果胶还原力及对DPPH·的清除能力Fig.3 Reducing power and scavenging effects on DPPH·of pectin

图4 VC对DPPH·的清除能力Fig.4 Scavenging effects on DPPH·of VC

在0.01%~0.22%浓度范围内,总黄酮还原力与总黄酮浓度呈现明显的量效关系。当总黄酮浓度为0.22%时,吸光度为0.969,表现出较强的还原力。在0.01%~0.22%浓度范围内,总黄酮对DPPH·均有清除作用,且在0.01%~0.17%范围内,随浓度的增加对DPPH·的清除能力逐渐增强;而在0.17%~0.22%浓度范围内,随浓度的增加总黄酮对DPPH·的清除能力趋于平缓。当浓度为8%时,总黄酮对DPPH·的清除率达到91.84%。

在0.05%~1%浓度范围内,果胶还原力与果胶浓度呈现明显的量效关系。当果胶浓度为1%时,吸光度为0.845,表现出较强的还原力。在0.05%~1%浓度范围内,果胶对DPPH·均有清除作用。在0.05%~0.8%范围内,随着浓度的增加,果胶对DPPH·的清除能力逐渐增强,随后呈现降低的变化趋势。当浓度为0.8%时,果胶对DPPH·的清除率达到84.97%。

表3 精油的抑菌活性Table 3 Inhibition effects of essential oils on three kinds of bacteria

注:同行不同小写字母表示差异显著(p<0.05),不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。表3~表5同。

表4 总黄酮的抑菌活性Table 4 Inhibition effects of flavonoids on three kinds of bacteria

表5 果胶的抑菌活性Table 5 Inhibition effects of pectin on three kinds of bacteria

2.4 柚活性成分的抑菌活性研究

柚皮精油、总黄酮和柚肉果胶的抑菌活性研究结果分别如表3~表5所示。抑菌圈实验结果的判定标准是:抑菌圈直径大于20mm为极度敏感,15~20mm为高度敏感,10~15mm时为中度敏感,7~9mm时为低度敏感,无抑菌圈者为不敏感[23]。研究结果表明,精油、总黄酮和果胶对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有较强的抑菌活性,且浓度越高抑菌作用越强。

纯精油和1.69%的总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均大于20mm,抑菌效果表现为极度敏感。当精油浓度为25.00%和50.00%时,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果均表现出极显著差异(p<0.01),抑菌圈直径均在10~15mm之间,抑菌效果均表现为中度敏感,而对金黄色葡萄球菌的抑菌效果差异显著(p<0.05),抑菌圈直径分别为(17.54±0.97)mm和(17.42±1.22)mm,抑菌效果表现为高度敏感。当总黄酮浓度为0.42%和0.84%时,对大肠杆菌的抑菌效果差异显著(p<0.05),对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果差异极显著(p<0.01);对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径均在10~15mm之间,抑菌效果表现为中度敏感,而对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(17.02±0.59)mm和(19.18±0.79)mm,抑菌效果表现为高度敏感。果胶浓度为2%和8%时,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果均没有表现出显著差异(p>0.05),对金黄色葡萄球菌的抑菌效果表现出极显著差异(p<0.01),当果胶浓度为8%时,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别为(11.61±2.12)mm和(10.06±1.63)mm,抑菌效果表现为中度敏感;而果胶浓度为2%时对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径分别为(8.74±1.79)mm和(8.85±1.88)mm,抑菌效果表现为低度敏感;果胶在受试浓度范围内对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在10~15mm之间,抑菌效果表现为中度敏感。

3 结论

柚皮中精油和总黄酮含量最高,分别为0.69%±0.10%和0.61%±0.04%;柚肉中果胶含量最高,为3.46%±0.28%。同时,通过气相色谱-质谱联用技术分析柚皮精油的化学成分,共鉴定出25种化合物,占总组分的99.24%。主要成分为D-柠檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%),β-蒎烯(2.14%),芳樟醇(0.77%),顺-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇(0.58%),p-薄荷-1-烯-8-醇(0.47%)等,其中多种成分为有机化工、食品、药品以及化妆品等行业的重要原料。柚皮精油、总黄酮和柚肉果胶均具有较强的还原力,且对清除DPPH·的IC50值分别为1.53%、0.07%和0.21%,表现出较强的抗氧化活性。柚皮精油、总黄酮和柚肉果胶对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有较强的抑菌活性,且随着浓度的增加,抑菌作用逐渐增强。

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Determination of contents,antioxidant andantibacterial activity of grapefruit extracts

ZHANG Fang,JIANG Yuan-yuan,YANG Yang,ZHANG Li*

(College of Biology and Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Extracted essential oils,flavonoids,and pectin from pomelo leaves,peel,grapefruit meat and seeds using the method of steam distillation,ultrasonic assisted solvent extraction and acid extraction and alcohol precipitation was studied. Essential oils was analyzed by using the method of gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Besides,the determination of total flavonoids and pectin used the method of NaNO2-Al(NO3)3and carbazole-sulfuric acid. Finally the antioxidant activity of essential oils,flavonoids and pectin was evaluated by using the method of reducing power and scavenging the capability of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·). And the antimicrobial activity was evaluated by using the method of filter paper diffusion. The results showed that,the contents of essential oils and flavonoids were the highest in the pomelo peel. And the contents of pectin were the highest in the pomelo meat. There were 25 kinds of compounds detected in pomelo peel oil,mainly D-limonene(77.96%),beta myrcene(12.40%)and beta pinene(2.14%). Pomelo three active ingredients(essential oils,flavonoids and pectin)had strong reducing power,and the IC50of DPPH·(the concentration of clearance rate were reached to 50%)were 1.53%,0.07% and 0.21%,respectively. Those all showed the strong antioxidant activity. There was different effect on the antibacterial of the three bacteria(Escherichiacoli,StaphylococcusaureusandSalmonellai). And with the increasing of mass concentration,the bacteriostatic effects of bacteria were gradually increased.

pomelo;essential oil;flavonoids;pectin;antioxidant activity;antibacterial activity

2014-04-08

张芳(1990-),女,本科,研究方向:应用化学。

*通讯作者:张利(1969-),女,博士,教授,研究方向:植物化学与成分分析。

四川农业大学大学生创新性实验计划项目(121062636);国家农业科技成果转化资金项目(2012GB2F000385);国家科技型中小企业技术创新基金项目(12C26215105863)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)03-0065-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.004

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