聚乳酸－聚三亚甲基碳酸酯／GDNF导管对大鼠脊髓损伤区GAP－43mRNA表达的影响

邵国喜，焦晶雪，刘钦毅，程兆华，李伟民

（吉林大学第二医院骨科，吉林长春130041）

聚乳酸－聚三亚甲基碳酸酯／GDNF导管对大鼠脊髓损伤区GAP－43mRNA表达的影响

邵国喜，焦晶雪，刘钦毅＊，程兆华，李伟民

（吉林大学第二医院骨科，吉林长春130041）

目的探讨PLA－PTMC／GDNF复合导管对脊髓损伤功能恢复的影响。方法我们采用RT－PCR的方法对GAP－43的mRNA表达进行分析，从基因水平上来检测植入PLA－PTMC／GDNF复合导管与其他治疗组GAP－43基因表达上的差异。结果术后第2周时，A组、B组、C组和D组的GAP－43mRNA相对表达水平与正常组相比明显增高；术后4周时，B组和D组的GAP43mRNA表达与第2周时相比明显增高，与A组和C组相比明显增高，有显著性差异；术后6周时，D组的GAP－43mRNA表达仍明显增高，与A组、B组和C组相比增高有显著性差异；第8周时各组GAP－43mRNA表达均有所下降，但D组的GAP－43mRNA相对表达水平与A组、B组和C组相比仍高，有显著性差异。结论PLA－PTMC／GDNF复合导管更有利于轴突再生的修复连接和脊髓损伤的功能恢复。

脊髓损伤；聚乳酸－聚三亚甲基碳酸酯；GAP－43mRNA；导管移植

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0198）

中枢神经系统的神经组织再生更具有挑战性，目前的治疗方法大都不能有效的充分恢复中枢神经系统的神经功能。为此我们研究聚乳酸－聚三亚甲基碳酸酯（PLA－PTMC）联合GDNF的复合导管对大鼠脊髓损伤修复作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物和分组

健康Wistar雌性大鼠，体重220－260g，随机分成为：正常对照组、完全脊髓横断组（A组）和治疗组，治疗组又按治疗方法的不同分为3组，即单一应用GDNF组（B组），单一应用PLA－PTMC导管植入组（C组），应用PLA－PTMC／GDNF复合导管植入组（D组）。每组实验动物9只，实验过程中，动物模型出现死亡，分析原因并改正，及时补充，并做标计，按照实验设计延时完成各项指标的评估。

1.2 PLA－PTMC／GDNF复合导管的制备

称取适量PLA－PTMC溶于乙酸乙酯中，加入GDNF冻干粉，超声分散法充分混匀。制成每根导管含GDNF 400U的PLA－PTMC／GDNF复合导管数根。

PLA－PTMC导管由济南健宝开元生物材料有限公司研究中心提供。GDNF由RD公司提供。

1.3 PCR引物

GAP－43引物根据GenBank所载大鼠GAP43的mRNA序列解设计，两条引物序列分别为：上游为5′－AGGGAGATGGCTCTGCTACT－3′，下游5′TCTTTACCCTCATCCTGTCG3′。基因扩增产物长度为406bp。

β－actin引物序列为上游：5′GAAATCGTGCGTGACATTAA3′，下游：5′CTAGAAGCATTTGCGGTGCA3′。基因扩增产物长度为511 bp。

以上引物均由赛百盛基因技术有限公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 将大鼠用10%水合氯醛（0.25ml／100g体重）腹腔注射麻醉，腰背手术区3.0cm×1.5cm剃毛，常规碘氟消毒，按肋骨确定椎体序列，纵向剪开皮肤，切口长约2.5cm。分离深筋膜及椎旁肌，显露出T9－T11锥体的椎板和棘突，直至关节突，用蚊式止血钳小心去除其棘突、椎板至关节突内侧面，暴露出脊髓硬脊膜，切开硬脊膜，用眼科剪横断脊髓，负压吸引出少许断端脊髓组织，使脊髓断端形成4 mm间隙，确保完全断裂。A组造模后直接关闭创口。B组脊髓完全横断后将装入GDNF的微型泵安置于皮下，此泵通过聚乙烯导管直接导入脊髓离断处，应用微型泵泵入GDNF溶液（2mg／ml），0.5 μl／h，持续3周。C组于脊髓损伤区移植PLA－PTMC导管。D组于脊髓损伤区移植PLA－PTMC／GDNF复合导管，导管由切口下端向上端植入脊髓断端间，用10－0无损伤线缝合硬脊膜。明胶海绵完全止血后，局部撒青霉素粉末2×105U，逐层缝合肌肉、深筋膜、皮肤，再次消毒。各组桥接方法完全相同。术后实行分笼饲养。正常对照组，不经手术处理，常规饲养。

1.4.2 半定量RT－PCR按试剂盒说明操作。取1 μl提取的RNA原液加299μl三蒸水，充分混匀，以三蒸水调零，紫外分光光度记检测各组标本RNA在260nm、280nm处的光吸收值，按下列公式计算RNA的浓度及纯度。

RNA的浓度：RNA（μg／μl）＝OD260×40×300（稀释倍数）×1000

RNA纯度检测标准：OD260／OD280＝1.8－2.0。定量后，取各组标本的总RNA各1μl在1%的琼脂糖凝胶以90V电压做稳压电泳，通过检测28S及18SRNA的亮度比值也对所提取的垂体的总RNA做完整度的检测。

1.4.3 RT－PCR扩增产物的鉴定与定量分析 取20μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，0.5%溴化乙锭染色20min。用Kodak凝胶电泳呈像分析系统（EDAS）进行电泳结果的拍照及电泳条带的强度分析，分别计算各组样品的目的基因扩增产物与内参照β－actin扩增产物的灰度比值来表示该目的基因的相对表达水平。

1.5 统计学处理

实验数据均以（¯x±s）表示，采用LSD（Leastsignificant difference）法进行两两间比较。由SPSS 13.0统计软件对结果进行统计分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA的质量检测

提取的RNA做1.0%的琼脂糖凝胶电泳。如图1所示，28S和18SrRNA的两条带均明显可见，且28S和18SrRNA两条带的强度之比大约为2，说明RNA完整性好，降解很少。

图1 RNA的质量检测

2.2 各组大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析

各实验组大鼠脊髓损伤区及正常对照组脊髓GAP－43mRNA相对表达水平比较见表1。术后第2周时，A组、B组、C组和D组的GAP－43mRNA相对表达水平与正常组相比明显增高，P＜0.05，A组、B组、C组和D组各组间GAP－43的mRNA相对表达水平无显著性差异；术后4周时，B组和D组的GAP43mRNA表达与第2周时相比明显增高，P＜0.05，与A组和C组相比明显增高，有显著性差异，P＜0.05；术后6周时，D组的GAP－43mRNA表达仍明显增高，与第4周时相比明显增高，P＜0.05，与A组、B组和C组相比增高有显著性差异，P＜0.05；第8周时各组GAP－43mRNA表达均有所下降，但D组的GAP－43mRNA相对表达水平与A组、B组和C组相比仍高，有显著性差异，P＜0.05（见图2）。

表1 各实验组大鼠脊髓损伤区及正常对照组脊髓GAP－43mRNA相对表达水平的比较（n＝3，¯x±s）

图2 各组大鼠脊髓组织中GAP－43及β－actin基因扩增产物电泳图

3 讨论

组织工程学中一种普遍的方法是模拟天然的细胞外基质结构。在所有研究中，都出现了生物合成物，尽管没有彻底的改变合成聚合物支架的降解速率和机械行为，但其对于促进神经细胞增殖与神经元延伸方面很有重要意义。这些材料同样可在生物体外应用于促进神经再生。制成人造移植物可以使其理化特性更适合于临床应用。PLA－PTMC能进行生物降解，并且不会引起排斥反应，还可以减少免疫反应的发生。为了更好的了解其在脊髓损伤修复机制，了解修复过程中脊髓组织分子水平的变化是很必要的，在此我们集中关注GAP－43，因其在脊髓损伤修复中多次被提及，其在神经系统发展、轴突再生、突触功能的形成起很重要的作用，其表达的显著与否用量化来描述，基于此目的我们采用RT－PCR法观察各组大鼠脊髓损伤区其量化的变化［1－3］。GAP－43是一种磷酸蛋白质，被认为是神经再生的相关蛋白质和关键因子，具有促进神经轴突生长发芽和突触连接形成作用，在神经系统发育、生长及创伤修复过程中可发挥重要作用。其是神经组织特有的生长相关蛋白，广泛分布于神经元、部分胚胎、再生的雪旺细胞和神经胶质细胞，在神经细胞中又以生长的神经纤维末端含量丰富［4］。它与轴突的生长密切相关。在神经元发育和再生中，是神经重塑和再生标志，最具有代表性，应用普遍［5］。它以快速轴突转运的方式从胞体到未梢，在生长过程中GAP－43选择性表达，它的轴突转运和合成在轴突再生和突触再生时高度的表达，而在突触形成后又会下降。本实验通过RT－PCR法分别检测术后2周、4周、6周和8周GAP－43在各组动物模型中的表达，观察PLA－PTMC／GDNF复合导管移植后大鼠脊髓GAP－43mRNA表达及功能恢复情况。本实验各组大鼠GAP－43、β－actin的RT－PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示，术后2周时，完全脊髓损伤组（A组）、单一应用GDNF（B组）、单一应用PLA－PTMC植入组（C组）、复合导管组（D组）的GAP43mRNA表达均增加，与正常对照组相比有显著性差异（P＜0.05），A－D各组间相比无显著性差异（P＞0.05），这表明虽然各组行为学评分这时得分较低，但轴突已开始有再生。术后4周时，D组与B组的GAP－43 mRNA表达相比无显著性差异（P＞0.05），但D组和B组分别与A组和C组相比增高明显，有显著性差异（P＞0.05），表明轴突再生较多。术后6周时，D组与A组、B组、C组的GAP－43mRNA表达相比增高明显，D组6周时与其4周时相比明显增高（P＜0.05），表明此时间点神经再生最活跃；8周时，AD组的GAP43mRNA表达较6周时下降，表明神经再生趋于稳定，D组的GAP－43mRNA表达与正常对照组及A－C组相仍增高（P＜0.05）。从上述GAP－43mRNA表达变化来看，虽在术后第4周时D组与B组相比差别无统计学意义，但在术后第4周、6周和第8周时D组与其它各脊髓损伤组（A组、B组、C组）的GAP－43mRNA表达均增高明显，且有统计学意义。而其他各脊髓损伤组各周GAP43 mRNA表达变化幅度不明显或仅有一个时间点上有明显改变。结果显示GDNF同PLA－PTMC导管二者协同作用能更为显著的促进中枢神经系统的神经再生。

综上所述，神经再生是一个复杂的过程，并具有挑战性的研究领域。在过去几十年的有关脊髓神经功能恢复的进展成果令人印象深刻。本实验为治疗SCI提供了一个新的方法，如果在本实验的基础上，进一步测试神经通过的成功率并改进PLA－PTMC／GDNF复合导管的性能，可进一步开展PLA－PTMC／GDNF复合导管治疗SCI的亚临床研究，为SCI的再生修复治疗带来了新的希望。

［1］Bock P，Spitzbarth I，Haist V，et al.Spatio－temporal development of axonopathy in canine intervertebral disc disease as a translational large animal model for nonexperimental spinal cord injury［J］.Brain Pathol，2013，23（1）：82.

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［3］Fumagalli F，Madaschi L，Caffino L，et al.Acute spinal cord injury reduces brain derived neurotrohic factor expression in rat hippocampus［J］.Neuroscience.2009，159（3）：936.

［4］Ji ZH，Zou W.The effects of stress on learning and memory［J］.Zhongguo Xingwei Yixue Kexue，2002，11（1）：12.

［5］Maier DL，Mani S，Donovan SL，et al.Disrupted cortical map and absence of cortical barrels in growth－associated protein（GAP）－43 knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（16）：93.

The influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the protein expression of GAP－43 mRNA in spinal cord injury of rats

SHAO Guo－xi，JIAO Jing－xue，LIU Qin－yi，et al.（The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the influence of PLA－Poly－PTMC／GDNF on the mRNA expression of GAP－43in spinal cord injury of rats.MethodsTo explore the mRNA expression of GAP－43at molecular biological level with RTPCR to make certain the difference between PLA－PTMC／GDNF and others.ResultsA，B，C，D groups showed high protein expression at 2weeks，and there is no significant difference among these groups.B，D groups had significant higher expression at 4weeks than that of two weeks.D group showed high protein expression at 6weeks than other groups and all groups showed higher expression.At 8weeks，all groups showed lower expression of GAP－43mRNA，but D group showed more expression than others.ConclusionPLA－Poly－PTMC／GDNF is more helpful for axon regeneration spinal cord recovery.

Spinal cord injury；PLA－poly trimethylene carbonate；glial cell line－derived neurotrophic factor；catheter implantation

R744

A

2014－07－30）

1007－4287（2015）02－0198－04

吉林省科技厅国际合作课题资助（20120721）

＊通讯作者