心复康联合骨髓间充质干细胞对心脏干细胞CD31和VEGFR2蛋白表达的影响*

王一婧，曾文赟，李虎虎，魏 冰，阚伯红，范英昌

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

在缺血应激时，血管新生是维持组织血液供应的关键机制，然而，机体自身代偿的血管形成和侧支循环有限，无法满足心肌对血供的需求。研究发现[1]，内源性心脏干细胞（CSC）在一定条件下可分化为内皮细胞，而心肌微血管内皮细胞在促进血管新生、建立侧支循环、保护缺血心肌的过程中起着重要作用[2]。但是由于体内CSC数量有限且分化力弱，其代偿作用难以实现[3]，而血管内皮细胞的增殖是血管新生的前提，故激活CSC向内皮细胞分化，成为促进心肌微血管生成的基本环节。

骨髓间充质干细胞（BMSC）是源于中胚层的早期细胞，具有自我更新和多向分化潜能[4]，多年来引起越来越多研究者的关注，并在组织工程、细胞治疗及器官移植等领域得到了广泛应用[5]。然而近期研究发现，非心肌细胞具有自分泌和旁分泌功能，可产生某些可溶性物质，影响细胞的结构和功能[6]，因此对BMSC的研究重点从促进其定向分化转为增强其旁分泌效应。在心肌组织中，外源性BMSC可通过旁分泌作用干预内源性CSC，促进CSC向内皮细胞分化，但两者的协同效应受到心肌缺血微环境的制约。

本课题组前期研究表明，心复康的主要成分能够促进心肌梗死周边区域的血管新生，从而改善该区域的血液供应及微环境[7]。由此提出假说，心复康可介导BMSC动员CSC分化为内皮细胞，并体外观察其联合BMSC对CSC的内皮细胞标记物CD31（CD31）和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）蛋白表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级1～3 d C57BL/6J小鼠20只，雌雄不分。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2014-0004。

1.2 主要试剂 DMEM/F12、碱性成纤维生长因子（Gibco），胎牛血清（Hyclone），β-巯基乙醇、非必需氨基酸、胰蛋白酶及胶原酶Ⅳ（Sigma），乙二胺四乙酸二钠、蛋白电泳相关试剂（上海生工），c-kit单克隆抗体、FITC标记的二抗（BD），磷酸盐缓冲液（PBS）、抗荧光淬灭封片剂（索莱宝），CD31及VEGFR2抗体（Abcam），酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（Uscn），GAPDH 抗体、山羊抗兔/小鼠二抗（中杉金桥），4%多聚甲醛固定液（博士德）。

1.3 主要仪器 超净工作台（HITACHI，日本），二化碳（CO2）培养箱（Thermo，美国），离心机（Eppendorf，德国），低温高速离心机（Sigma，美国），流式细胞分选仪（BD，美国），酶标仪（岛津，日本），倒置相差光学显微镜、正置荧光显微镜（Leica，德国），电泳装置（北京六一仪器厂，中国），湿性转膜仪（GE，美国），凝胶成像系统（Biorad，美国），恒温振荡箱（上海智诚，中国）。

2 方法

2.1 BMSC培养及心复康含药血清的制备 鉴定具体方法参见文献[8]，心复康组成：西洋参15 g，白术 15 g，枸杞子 15 g，女贞子 10 g，鹿衔草 10 g，昆布10 g，降香 10 g。

2.2 心复康对BMSC分泌SDF-1α的影响 将第3代BMSC以1×105/mL的密度分3组接种于96孔板，每孔100 μL，24 h后（待细胞贴壁），以含不同血清（10%胎牛血清、10%对照血清、10%含药血清）的DMEM处理3组细胞。72 h后收集各组条件培养液，3 000 r/min离心15 min，取上清液，按照ELISA说明书测定其中基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）的浓度。

2.3 CSC的培养及鉴定

2.3.1 CSC原代培养 采用75%医用乙醇予新生小鼠消毒，于超净台中剪下心脏，去除大血管蒂和心脏下1/3部分，以PBS冲洗血液至液体澄清，然后将组织剪成1~2 mm3的小块。向组织块加入2 mL混合消化液（含2.5 g/L胰酶和1 g/LⅣ型胶原酶），吹打30 s，置于37℃恒温振荡箱内振荡（每分钟40次），5 min，弃上清。以上操作反复3次，以200目筛网过滤消化液，用CSC完全培养基（含15%胎牛血清，5 μg/L bFGF，1%非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM/F12）冲洗组织块。最后用显微镊将组织块转移至6孔板内，加入1 mL全培（目的为保持组织块湿润），置于含5%CO2的37℃培养箱中培养8 h后，轻摇6孔板，观察组织块是否贴壁牢固，再加入1.5 mL全培继续培养。

2.3.2 流式细胞鉴定和分选 将原代细胞用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，以1 000 r/min离心5 min收集细胞。细胞密度调整为5×106~1×107/mL。采用生物素标记的c-kit单克隆抗体与FITC标记的抗生物素二抗，分别室温孵育细胞2 h，一抗和二抗反应结束后，PBS冲洗细胞3次，经0.45 μm筛网过滤。将未做标记的细胞作为空白对照（调节电压），先进行标记率检测，后作分选。将收集到的细胞用CSC全培培养，2~4 h后更换全培，每2~3 d换液1次。

2.3.3 细胞免疫荧光鉴定 贴壁的CSC用4%多聚甲醛固定15 min后，以封闭血清室温孵育1 h，ckit一抗室温孵育2 h，FITC标记的二抗室温避光孵育1 h，最后滴加抗荧光淬灭封片剂，荧光显微镜下观察并采集图像（注：固定及孵育后需用PBS洗3 遍，每遍 10 min）。

2.4 实验分组 包括对照组、心复康组及抑制剂组。将CSC全培重悬的CSC以1×105/mL的密度接种于Transwell小室内（抑制剂组的CSC用含10 mg/L AMD3100的全培预孵育1 h），下室接种BMSC全培重悬的BMSC（密度同上）。24 h后，对照组下室换含10%对照血清的DMEM，心复康组、抑制剂组下室换含10%含药血清的DMEM，各组小室内仍换CSC全培，将细胞置于含5%CO2的37℃培养箱中，72 h后进行检测。

2.5 CD31和VEGFR2蛋白表达的Western Blot分析 按照试剂说明书裂解细胞，用BCA法测定蛋白浓度。以25 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，分离后的蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭，一抗4℃孵育过夜。二抗室温孵育，加入ECL发光液成像。以GAPDH为内参，计算各组CD31、VEGFR2与内参灰度值之比值，作为蛋白相对表达量。

2.6 数据统计与分析 使用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所得结果以均数±标准差（s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05表示组间差异有统计学意义，统计作图采用Origin 8.0软件。

3 结果

3.1 BMSC分泌SDF-1α的结果 通过标准品计算各组样本中SDF-1α蛋白的浓度表明，BMSC具有分泌SDF-1α的能力，与胎牛血清（FBS）组和对照血清（Control）组相比，含药血清（XFK）组 BMSC 分泌SDF-1α的能力明显增强，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 1。

3.2 CSC培养结果 培养板中接种的组织块约6 h大部分可贴壁，培养3 d后即有成纤维细胞和小而亮的CSC从组织块中爬出，约14 d后大部分细胞已从组织块中爬出。见图2。

3.3 CSC流式细胞鉴定结果 流式细胞鉴定结果显示，c-kit阳性细胞所占比例在15%左右，将分选所得的c-kit阳性细胞反复收集，继续培养，将收集的细胞增殖、传代后继续采用c-kit鉴定。见图3。

图1 各组SDF-1α的浓度

图2 CSC原代培养图片（×200）

图3 组织块培养法所得细胞分选前c-kit阳性标记细胞情况

3.4 CSC免疫荧光鉴定结果 培养数代后以c-kit一抗进行细胞免疫荧光染色发现几乎全部细胞上均有c-kit表达，表明该培养条件适合CSC生长，细胞基因稳定，其干细胞潜能仍保持不变。见图4。

图4 CSC免疫荧光鉴定（×200）

3.5 心复康联合BMSC对CSC的CD31和VEGFR2蛋白表达的影响 Western Blot结果提示，与对照组（C）和抑制剂组（XFK+AMD3100）相比，心复康组（XFK）CSC的CD31和VEGFR2蛋白表达显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

图5 各组CSC的CD31和VEGFR2蛋白表达情况

4 讨论

CSC 表面主要表达 c-kit+、Sca-1+和 MDR1+，其中约65%的CSC同时表达上述3种抗原，约20%的CSC同时表达其中两种抗原，约有15%的CSC只表达其中一种抗原[9]。干细胞表达的抗原不同，在生长和分化方面的潜能也不同，体外实验表明，c-kit+细胞分化能力强于MDR1+、Sca-1+和c-kit+/MDR1+/Sca-1+细胞。同时，c-kit+细胞的表型稳定，能在体外充分扩增而不失去扩增能力[10]。

SDF-1属于CXC趋化因子超家族，SDF-1α最初从骨髓间充质细胞分离得到，广泛表达于多种组织，主要的生物效应是诱导基质金属蛋白酶和血管生成因子的趋化、黏附、运动及分泌作用[11]，同时可激活CSC向内皮细胞分化[12]，并刺激内皮细胞的增殖、迁移和血管形成。SDF-1α/CXCR4信号途径在血管形成和心脏发生中起基础作用，如募集血管干/祖细胞，刺激血管生成因子的产生，促进内皮细胞迁移形成新血管等[13]。AMD3100为SDF-1α受体阻滞剂，用其预处理CSC，使共培养体系中BMSC分泌的SDF-1α不再发挥作用。

CD31存在于内皮细胞间紧密连接处，且常位于血管内皮细胞，可能与血管生成有关。

VEGF在胚胎血管发育、成体血管新生及血管通透性调节过程中是必不可少的[14]，主要通过与两个受体酪氨酸激酶（VEGFR1和VEGFR2）结合而发挥生物学作用[15]。VEGFR1是VEGF的高亲和力受体，与VEGF结合后竞争性抑制VEGFR2活性，具有负调控作用[16]。而VEGFR2是实现内皮细胞增殖、迁移、血管新生及血管通透性增加的最主要受体，结合VEGF的VEGFR2引起受体二聚化、激酶激活及酪氨酸残基自身磷酸化[17]，调控下游基因表达，从而诱导内皮细胞存活、增殖和迁移。研究表明，基因敲除VEGFR2可阻断内皮细胞分化，导致胚胎早期死亡。因此，VEGFR是血管新生的关键调节者，VEGF与其结合激活细胞内信号通路，诱导内皮细胞增殖、迁移，在血管新生的过程中是不可或缺的。

西洋参茎叶总皂苷可促进缺血心肌内源性VEGF的合成与分泌，从而促进心肌血管新生，血管密度增加，改善心肌微循环，具有保护心肌缺血性损伤的作用[18]。补肾中药可诱导干细胞向心肌细胞及血管内皮细胞分化，在心血管系统再生修复治疗方面有积极作用。枸杞子、女贞子均属于补肾中药，对干细胞长期生长分化无毒，且利于分化后细胞活体移植[19]。鹿衔草总黄酮对扩张冠状动脉，增加血管灌注液流量，增强心肌收缩力，抗心律失常等有明显效应[20]。绛香能促进体外内皮细胞的增殖，具有促血管新生作用，不但促进促血管新生因子的表达，而且降低血管抑素和内皮抑素的表达，从而使血管生长各因子的平衡向促进血管新生的方向发展[21]。

本研究显示，心复康协同BMSC能够上调CSC中CD31和VEGFR2的蛋白表达，而AMD3100可显著阻滞其上调作用。由此提示，心复康与BMSC协同具有促进CSC向内皮细胞分化的潜能，而SDF-1α/CXCR4轴是其中的作用机制之一。

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