小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能实验的改进*

周会芳，徐 倩，边育红，刘晓辉，李 丹

（天津中医药大学中西医结合学院，天津 300193）

吞噬实验是微生物学与免疫学实验教学中的经典实验，实验目的主要用于观察机体内巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬外来异物的能力，从而反映机体的天然免疫防御功能[1-3]。吞噬细胞是一类能吞噬、清除病原体的重要效应细胞，包括中性粒细胞和单核-巨噬细胞。中性粒细胞又称小吞噬细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞[4-5]。

大吞噬实验是通过观察巨噬细胞对异物颗粒（如鸽子红细胞[6]、鸡红细胞[7-8]、荧光颗粒[9-11]、鱼红细胞等[12]）的吞噬能力，来评价吞噬细胞的功能和反映非特异性免疫应答能力[13-14]。传统的大吞噬实验中多采用鸽子红细胞或者鸡红细胞作为吞噬颗粒腹腔注射到小鼠体内，通过对腹腔液进行涂片、Giemsa染色观察体内的巨噬细胞对鸽子红细胞或者鸡红细胞的吞噬现象来反映巨噬细胞的吞噬功能[6,15]。染色后的鸡红细胞具有个体大呈梭型，并且核着色清楚等优点，本教研室对免疫学中的大吞噬实验一直采用这种传统的方法来进行，但是近几年发现这个实验过程中也存在一些缺点，比如购买鸡或者鸽子的流程不方便和鸡红细胞或鸽子红细胞制备比较麻烦等，使得每次实验课需要花费一半的时间在红细胞的制备上，让学生在实验课上把握不好时间，很大的降低了学习效率，更重要的是前几年高校中致病性禽流感的发生[16-18]，致使禽类动物在本科教学实验中的使用受到很大的限制，为了避免实验过程中的不安全因素，并结合学校对医学免疫学大吞噬实验课的教学安排和相应的仪器设备，急需在原有的实验基础上对实验中存在的不安全因素做一些改革来适应新的实验教学计划。本实验根据以往的实验课教学经验和查阅相关文献，用3%硫代乙醇酸钠溶液激活腹腔巨噬细胞，将吞噬颗粒鸡红细胞换成酵母菌，分别比较巨噬细胞体内对鸡红细胞和酵母菌的吞噬功能（包括吞噬百分率和吞噬指数），为改进医学免疫学中大吞噬实验的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：健康昆明白雄性小鼠，体质量18~22 g，由天津中医药大学实验动物中心提供，颗粒饲料喂养。

主要试剂和仪器：硫代乙醇酸钠购自上海谷研实业有限公司，酵母粉购自上海根生生物科技有限公司，胰蛋白胨和琼脂粉购自北京三药科技开发公司，枸橼酸钠和氯化钠购自天津市北方天医化学试剂厂，酵母菌购自中国医学细菌保藏管理中心，吉姆萨染料购自南京建成生物工程研究所，甲醇均由天津市光复试剂研究所提供，0.9%氯化钠注射液由石家庄四药有限公司提供，一次性无菌注射器等耗材均为山东瑞通高分子医疗器械有限公司，光学显微镜为奥林巴斯，离心机为湖南湘仪离心机仪器有限公司，恒温培养箱为广东省医疗器械厂。

1.2 3%硫代乙醇酸钠的制备 称取硫代乙醇酸钠3 g，溶于100 mL的0.9%氯化钠注射液中，121℃高压灭菌20 min，放4℃冰箱备用。

1.3 3.8%枸橼酸钠溶液的制备 称取枸橼酸钠3.8 g，溶于100 mL的0.9%氯化钠注射液中，121℃高压灭菌20 min，放4℃冰箱备用。

1.4 5%鸡红细胞悬液制备 用湿棉花擦拭鸡翅膀根部，拔掉羽毛，用乙醇棉球擦拭，使血管充盈，用含1/10抽血比例的枸橼酸钠溶液的一次性10 mL注射器从远心端进针，抽取鸡翅膀血5 mL，分装到10 mL容量的圆底离心管中，经1 500 r/min，10 min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入10倍以上血量的0.9%氯化钠注射液，上下颠倒轻轻混匀，再次离心弃去上清液，重复离心3次直至上清液透明无血色，按红细胞压积用0.9%氯化钠注射液配置5%的鸡红细胞悬液，放4℃冰箱备用[7,19]。

1.5 LB（Luria－Bertani）斜面培养基的制备 将胰蛋白胨 1 g，酵母粉 0.5 g，氯化钠 1 g，琼脂粉 2 g，加入蒸馏水至100 mL，调整pH值7.0后分装至15 mL的瓶口试管中，用牛皮纸包好，121℃高压灭菌20 min，取出后将培养基趁热做成斜面，斜面长度占试管总长度的1/2，凝固后若试管内有冷凝水，放在37℃左右的培养箱内烘去冷凝水，放4℃冰箱备用。

1.6 酵母菌菌液的制备 用接种环将酵母菌接种到LB斜面培养基上，37℃恒温培养箱培养24 h后，每支培养基中加0.5 mL的0.9%氯化钠注射液反复吹打冲洗斜面培养物上的酵母菌，收集酵母菌液，参照麦氏标准比浊管，将酵母菌液用0.9%氯化钠注射液调至浓度为1×109cfu/ml[20]，放4℃冰箱备用。

1.7 吞噬实验 将小鼠随机分成3组，每组9只。第1组为空白对照组，第2组鸡红细胞组，第3组酵母菌组，每只小鼠经腹腔注射3%硫代乙醇酸钠溶液3 mL，诱导小鼠产生腹腔巨噬细胞。96 h后，第1组空白对照组每只小鼠经腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.6 mL，第2组鸡红细胞组每只小鼠经腹腔注射鸡红细胞悬液0.6 mL，第3组酵母菌组每只小鼠经腹腔注射酵母菌0.6 mL，全部注射后轻柔腹部。注射10、30、60 min后，取对照组、鸡红细胞组和酵母菌组各3只小鼠，颈椎脱臼处死，腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 mL，轻轻按摩腹部后，消毒腹部皮肤后剪开腹中部皮肤一小口，用毛细吸管取出每组小鼠腹腔液，将每组每只小鼠取腹腔液滴于3张玻片，用另一张玻片推片，自然干燥后丙酮-甲醇溶液固定5 min。将固定好的玻片滴加Giemsa染液10 min后，自来水冲干净，在显微镜油镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬鸡红细胞和酵母菌的现象，并计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率：每100个吞噬细胞中吞有鸡红细胞或酵母菌的吞噬细胞数。吞噬指数：将100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞或酵母菌的总数除以100。

2 实验结果

将做好的玻片标本放在油镜下，空白对照组中小鼠腹腔巨噬细胞形态轮廓清晰，形状呈圆形或椭圆形，形态典型，见图1a。巨噬细胞吞噬酵母菌数量较多，且吞噬的酵母菌数从一个到几个不等，还有部分酵母菌黏附在巨噬细胞外围，见图1b。而巨噬细胞吞噬鸡红细胞数较少,且视野中鸡红细胞和小鼠红细胞不易区分，见图1c。

图1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬酵母菌和鸡红细胞

小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞和酵母菌的吞噬百分率差不多，但是从小鼠巨噬细胞对鸡红细胞和酵母菌的吞噬指数可以看出，巨噬细胞对酵母菌的吞噬数量比吞噬鸡红细胞数量大，说明巨噬细胞对酵母菌的吞噬能力更强。见表1。

表1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞和酵母菌的吞噬百分率

3 讨论

大吞噬实验是重要的免疫学实验，里面涉及到的实验技能比较全面，包括实验动物的正确捉拿方法、小鼠腹腔注射方法、细胞涂片染色方法、显微镜的使用等多项技能。因为本实验的授课对象为大学2年级学生，初次接触这种综合性的实验，因此明显的实验结果，简单的操作步骤有助于学生掌握基本实验技能，在此基础上更好地加深对理论知识的理解与运用。

机体内巨噬细胞、中性粒细胞等都具有吞噬功能，这些细胞的功能正常与否关系到免疫应答的抗原提呈过程和抗原清除能力。在体内激活的巨噬细胞能吞噬异物颗粒，包括鸽子红细胞、鸡红细胞和酵母菌等，这其中酵母菌相对更安全，而且稳定比较好，适合做大吞噬实验中的吞噬颗粒[21-22]。

吞噬实验中，采用Giemsa染色光学显微镜观察巨噬细胞对吞噬颗粒的吞噬现象，计算其吞噬百分率和吞噬指数来评价巨噬细胞的吞噬清除异物的能力[23]，吞噬指数越大，说明巨噬细胞对吞噬颗粒的吞噬能力越大。本实验通过比较小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞和酵母菌的吞噬作用，发现注射吞噬物30 min后即出现吞噬现象，更方便学生对实验课时间的把握。和吞噬鸡红细胞组相比，巨噬细胞对酵母菌的吞噬现象更明显，通过比较其吞噬指数，说明巨噬细胞对酵母菌的吞噬能力更强。

本实验中，将吞噬物鸡红细胞换成酵母菌，省去每组制作鸡红细胞悬液过程中采集鸡血和多次离心的时间，有利于学生对实验课时间的安排。一次保存的酵母菌可以用于多次巨噬细胞吞噬功能的实验，并且能保证实验稳定性。酵母菌在体外进行Giemsa染色后颜色明显，和小鼠红细胞等其他杂质容易进行区分，有利于学生进行观察和计数，有助于学生对巨噬细胞吞噬作用的理解和掌握。

可溶性淀粉、蛋白胨溶液等物质可激活巨噬细胞，使其吞噬异物的能力加强，但也有实验结果表明效果并不十分理想[24]。研究表明[25-26]，用硫代乙醇酸钠溶液作为巨噬细胞的刺激剂，结果比较稳定，提前4 d给小鼠腹腔注射3%的硫代乙醇酸钠溶液激活巨噬细胞，使巨噬细胞大量游出，与传统方法中使用淀粉溶液的方法更稳定。为了适应新的教学大纲，提高学生的学习效率，需要不断的努力探索，找到简单而且高效的实验方法，除了以上的这些改革，笔者计划根据实验和实验条件的要求进行体外大吞噬实验，即将硫代乙醇酸钠诱导的小鼠的腹腔巨噬细胞取出，在体外进行巨噬细胞吞噬酵母菌的实验，直接为学生提供小鼠腹腔巨噬细胞，这样既不需要使用动物进行实验，更节省了时间，有利于开展新的免疫学实验，又避免了小鼠腹腔内其他杂细胞的干扰，影响吞噬现象的观察。

本实验结果显示，小鼠巨噬细胞在体内对酵母菌的吞噬能力比对鸡红细胞强，而且酵母菌容易获得，重复性好，更无传播疾病的危险，适合做大吞噬实验中的吞噬颗粒。在改进此实验方法的基础上，希望根据这个实验进一步设计出适合中医药专业的综合性实验，如：使用中药后对吞噬细胞活性、吞噬功能及氧化损伤的影响[27-28]，或者引导学生自主设计相关实验，筛选有促进或者抑制吞噬细胞功能的中药，对吞噬现象的机制进行探讨，同时也有利于学生对知识点的掌握程度，更加强学生对中药在免疫学应用中的理解，较大的激发学生的主动学习和创新能力。

综上所述，大吞噬实验中，用3%硫代乙醇酸钠溶液激活巨噬细胞，并将吞噬物鸡红细胞换成酵母菌，能更好的观察巨噬细胞对酵母菌的吞噬作用，并且结果判断容易，操作方法简单，可用于各类医学院校的免疫实验教学。

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