结核分枝杆菌去乙酰化酶2的克隆及酶学研究

林雅宁,董 剑，徐忠玉(中国人民解放军第一七五医院/厦门大学附属东南医院检验科，福建漳州 363000)



·论 著·

结核分枝杆菌去乙酰化酶2的克隆及酶学研究

林雅宁,董 剑，徐忠玉(中国人民解放军第一七五医院/厦门大学附属东南医院检验科，福建漳州 363000)

目的 构建结核分枝杆菌去乙酰化酶2(Sir2)原核表达载体，并进行表达纯化及酶学研究。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，聚合酶链反应扩增Sir2基因，构建pET-28a-Sir2重组质粒，在E.coli BL2(DE3)中诱导表达蛋白，经Ni2+-NTA柱纯化，最后通过去乙酰化酶试验测定Sir2酶活的最适反应温度和pH值，以及吡嗪酰胺对其酶活的影响。结果 成功构建了Sirt2原核表达载体，并能在E.coli BL21(DE3)中高效表达。随后对纯化的Sir2蛋白进行依赖于NAD+的去乙酰化活性研究，得到该酶的最适反应温度是25 ℃，最适反应pH值是9.0。在偏酸性环境中，吡嗪酰胺对酶活有抑制，而在偏碱性环境中，没有抑制作用。结论 利用分子克隆技术，获得了高纯度的Sir2蛋白并获得其酶活最适反应温度和最适pH值，及吡嗪酰胺对其有抑制效果，为研究抗结核药物吡嗪酰胺的抑菌机制提供一定基础。

结核分枝杆菌； 去乙酰化酶； 基因克隆； 蛋白纯化； 吡嗪酰胺

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)是目前全球最可怕的流行性致病菌之一，结核病在我国的发病率呈回升趋势[1-3]。随着化疗药物的广泛应用，结核杆菌的耐药率日趋上升，特别是耐多药结核病(MDR-TB)，给结核病的控制工作带来巨大困难[4-5]。因此，寻找一种有效的药物靶标分子的任务迫在眉睫。去乙酰化酶(Sir2)蛋白是一类依赖于NAD+的去乙酰化酶，它在细胞的长寿与衰老、基因沉默、凋亡等生理活动中具有十分重要的调节作用[6]。近年来Li发现了Sir2参与了分枝杆菌的非同源末端连接修复[7]。Sir2抑制p53蛋白的乙酰化，从而抑制依赖于p53蛋白的细胞凋亡，使DNA损伤修复有更充裕的时间[8]。Sir2蛋白具有ADP-核糖基转移酶活性和依赖于NAD的去乙酰化酶。烟酰胺是Sir2家族蛋白的天然抑制物，早期研究发现烟酰胺对结核菌有良好的抑制效果，因此，作者猜测PZA的作用机制可能与Sir2有关[9-10]。本文克隆表达结核分枝杆菌的Sir2蛋白，对它的去乙酰酶活进行鉴定，并检测PZA对其抑制效果，期望通过对结核分枝杆菌Sir2蛋白的研究，能为抗结核病药物PZA的作用机制和耐药机制提供新线索，为结核新药的设计和筛选提供靶标和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 结核分枝杆菌H37Rv由漳州疾控中心赠送，用于克隆、表达的质粒pET28a，大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)均由本实验室保存。

1.2 仪器与试剂 聚合酶链反应(PCR)仪购自美国ABI，Ni2+-NTA树脂购自Novagen公司，电泳装置购自BIO-RAD公司，荧光光度计购自Bio-TEK公司。DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶均为Takara公司产品。PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，底物Boc-lys(Ac)-AMC为Omega公司产品。

1.3 方法

1.3.1 Sir2基因的扩增和克隆 从Genebank中获得结核分枝杆菌的Sir2(Rv1151c)基因的全核苷酸序列714 bp，使用Primer 5.0软件设计引物扩增，上游引物：5′-TACTCCATGGTTATGCGAGTGGCGGTGCTCA-3′和下游引物：5′-ATTAGACTCCTATTTCAGCAGGGCGGGCA-3′。在上下游引物中分别引入酶切位点NcoⅠ和SacⅠ。PCR扩增循环条件为：95 ℃ 5 min，一个循环；95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s，进行30个循环反应；最后72 ℃延伸7 min。基因PCR扩增后琼脂糖凝电泳回收目标条带，胶回收后产物用NcoⅠ和SacⅠ双酶切消化后与载体pET-28a进行连接，然后转化入E.coli BL21得到E.coli BL21/pET-28a-Sir2，经过表达验证、酶切验证或PCR验证后进行全基因测序。

1.3.2 Sir2的表达和纯化 重组菌株在相应的抗菌药物LB培养基中培养过夜后接种于新鲜的LB中，OD600为0.5时加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃诱导10 h。利用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化蛋白。SDS-PAGE检测纯度，浓度用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定。

1.3.3 Sir2依赖于NAD+的去乙酰化酶活性 本试验利用乙酰化荧光底物Boc-lys(Ac)-AMC和NAD+作为反应底物测定依赖于NAD+的去乙酰化酶活性。测定酶活的反应体系组成：20 mmol/L Tris-HCl缓冲 (pH8.0)，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L KH2PO4，250 mmol/L EDTA，500 μmol/L NAD+，20 μmol/L 荧光底物，20 μg His-Sir2重组酶，以不加入NAD+和不加入酶的反应作为阴性对照。进行酶反应条件优化，以获得较佳的酶反应条件。反应混合物避光静置，于一定恒温反应2 h。终止反应：加入60 μg/mL胰蛋白酶，37 ℃保持30 min。然后使用酶标仪测定荧光值(激发光340;发射光460)。PZA抑制试验：在上述反应体系内，加入梯度浓度的已知PZA。反应混合物避光静置，于25 ℃恒温反应2 h，然后加入终止缓冲液，于37 ℃反应30 min，测定荧光(激发光340;发射光460)。

2 结 果

2.1 结核分枝杆菌Sir2表达载体的构建与验证 从结核分枝杆菌基因组中PCR扩增出全长714 bp的Sir2基因片段，通过基因工程连接到pET-28a载体中，酶切验证后进行全基因测序，见电泳图1。

注：泳道M，DNA Marker DL 2000 plus;泳道1，重组质粒pET-28a-Sir2;泳道2，重组质粒pET-28a-Sir2 NcoⅠ和SacⅠ双酶切。

图1 pET-28a-Sir2重组质粒的鉴定

2.2 结核分枝杆菌Sir2的表达及纯化 对表达菌株E.coli BL21/pET-28a-Sir2先进行了Sir2蛋白表达条件的优化和可溶性分析，发现该蛋白在表达时形成大量包涵体。通过摸索发现，在0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃诱导下，有利于形成可溶性蛋白，因此，采取该条件进行该蛋白的大量表达。经过特异亲和层析，获得纯的Sir2蛋白见图2，目的条带约30×103。

2.3 Sir2依赖于NAD+的去乙酰化酶活性测定 首先用荧光法测Sir2蛋白依赖于NAD+的去乙酰化活性。结果显示，阴性对照值荧光强度范围在50左右，而添加了His-Sir2重组酶的荧光值在1 000左右，说明Sir2确实具有依赖于NAD+的去乙酰化活性。

注：泳道M，蛋白 Marker；泳道1，pET-28a菌株对照;泳道2，pET-28a-Sir2重组子；泳道3，纯化的Sir2蛋白。

图2 SDS-PAGE分析Sir2蛋白

2.3.1 最适合反应温度和pH值 测定了不同温度和pH条件下Sir2的去乙酰化酶活性。结果显示，25 ℃下Sir2蛋白的酶活力最强，见图3。最适pH值试验表明，pH<7时随着pH降低，酶活逐渐降低；pH>7时，随着pH的升高，活力逐步加强，在pH 9左右达到顶峰，最适反应pH值为9，见图4。

图3 Sir2酶活最适反应温度曲线

图4 Sir2酶活最适反应pH值曲线

2.3.2 PZA抑制试验 在偏酸性(pH5.5)环境和偏碱性环境(pH8.0)中测定不同浓度PZA对Sir2酶活的影响。在偏碱性条件PZA对Sir酶活没有抑制效果；偏酸性条件，PZA表现出抑制活性，但抑制强度弱，600 μmol/L浓度下酶活力仍保持80%，且随着浓度增大抑制效果增强不明显。

3 讨 论

Sir2蛋白是一类依赖于NAD+的去乙酰化酶，它的序列从原核生物到真核生物都很保守,但不同物种间Sir2蛋白还是会存在差异[11-12]。结核杆菌Sir2基因GC水平达到66.80%。外源表达条件下容易产生包涵体，这可能与大肠菌内缺乏辅助结核菌Sir2折叠的分子伴侣有关。本研究通过诱导条件的优化，最后在OD600为0.5时加入0.4 mmol/L的IPTG，18 ℃诱导10 h，蛋白可溶性提高，有利于蛋白质的纯化和保持生物学功能。本研究证明了结核分枝杆菌Sir2蛋白是依赖于NAD+的去乙酰化酶，其活性对温度和pH值是敏感的。37 ℃左右酶失去大部分活性，而37 ℃本是结核菌在人畜体内生存时的实际环境温度，原因可能是体外反应条件不足以完全恢复其在体内的活力。

PZA是一种重要的抗结核菌药物，对处于酸性环境中缓慢生长的吞噬细胞内的结核菌来说，PZA是目前最佳杀菌药物。在体内它并非直接作用于病菌，而是依靠病菌自身的吡嗪酰胺酶将其活化成为吡嗪酸，才能起作用，但是其作用靶点至今不明确。本研究发现偏碱性条件PZA对Sir酶活没有抑制效果；偏酸性条件，PZA表现出弱的抑制活性。

总之，本试验构建了结核菌的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。通过优化诱导条件最后纯化到该蛋白，试验也证明了Sir2具有去乙酰化酶活性，最适反应温度是25 ℃，pH9.0，偏酸性环境中PZA对其有较弱的抑制作用。本研究表明吡嗪酰胺的作用机制可能与Sir2有关。

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Study on cloning and enzymology of deacetylase protein Sir2 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv

LINYa-ning,DONGJian,XUZhong-yu

(DepartmentofClinicalLaboratory,175HospitalofPLA/AffiliatedDongnanHospitalofXiamenUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To construct the deacetylase protein Sir2 prokaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis(MTb) and to conduct the expression purification and enzymologic study.Methods Sir2 gene was amplified from MTb H37Rv genomic DNA as the template by PCR and then the recombinant plasmid pET-28a-Sir2 was constructed.The expression protein was induced in E.coli BL2(DE3) and purified by Ni2+-NTA afinity chromatography.Finally the optimal reaction temperature and pH value of Sir2,and influence of pyrazinamide(PZA) on enzyme activity were detected by the acetylation enzyme test.Results Sir2 prokaryotic expression vector was successfully constructed and could be highly expressed in E.Coli BL21(DE3).Then the purified Sir protein was conducted the NAD+dependent deacetylation activity research.The obtained optimal pH was 9.0 and the optimal reaction temperature was 25 ℃.PZA had the inhibition effect to the Sir2 enzymatic activity under weakly acidic environment,but without the inhibiting effect under the basic pH environment.Conclusion The highly purified protein is obtained by using themolecular cloning technique,the optimal pH and optimal reaction temperature are also obtained,PZA has the inhibiting effect on it,which provides certain foundation for researching the antibacterial mechanism of ant-tuberculous drug PZA.

mycobacterial; deacetylase; gene clone; expression and purification; PZA

林雅宁，女，硕士，技师，主要研究免疫学和临床检验方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.021

A

1672-9455(2015)18-2703-02

2015-04-11

2015-05-15)