不同pH值条件下3种大环内酯类抗菌药物的抗菌活性及耐药性

高慧莉,罗光明(第三军医大学第一附属医院：.药剂科;2.呼吸科，重庆 400038)



·论 著·

不同pH值条件下3种大环内酯类抗菌药物的抗菌活性及耐药性

高慧莉1,罗光明2△(第三军医大学第一附属医院：1.药剂科;2.呼吸科，重庆 400038)

目的 不同pH值条件下3种大环内酯类药物对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的耐药性和最小抑菌浓度(MIC)。方法 在pH6.0、pH7.0和pH8.0条件下，采用肉汤稀释法分别检测大环内酯类抗菌药物对临床分离金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌MIC及细菌耐药性。结果 随着pH值的增加，大环内酯类抗菌药物对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的MIC值均有不同程度的降低，并呈一定的依赖效应,其中罗红霉素和阿奇霉素的抑菌活性强于红霉素；体外诱导试验表明，在所有试验pH值条件下，MIC值均有所增加，但是随着pH值的增加细菌的MIC值逐渐降低。结论 大环内酯类抗菌药物的MIC随培养基pH值升高而逐渐降低，在一定pH值范围内大环内酯类抗菌药物可提高金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的抗菌作用。

大环内酯类； 抗菌活性； 细菌耐药性； pH值

抗菌药物的体外活性和体内药代动力学对细菌生长培养基或人体体液的pH值敏感。生物被膜可以保护细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主的免疫，同时膜内的细菌在适宜的条件下又可以从膜内扩散游离，引起机体的再次感染，给临床治疗带来困难[1]。有文献认为，大环内酯类药物如14-元环大环内酯类药物红霉素、克拉霉素、罗红霉素及15-元环大环内酯类药物阿奇霉素，可抑制生物被膜合成，促进抗菌药物渗透[2]。大环内酯类含有1个第3位可离子化的氨基糖[3-4]。因此，在酸性培养基中，大环内酯分子因被离子化而降低到达细菌细胞内的数量，从而导致抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)的增加[5]。与红霉素、罗红霉素相反，阿奇霉素含有1个二甲氨基[6]。这个第2位可离子化的基团有一个较高的pKa，增加了氨基被离子化的可能性，从而使阿奇霉素很难进入细胞。因此，阿奇霉素的活性对pH值变化特别敏感。为了进一步探讨不同pH值对大环内酯类抗菌药物的影响，本研究以金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌为试验对象，在不同pH值条件下检测抗菌药物的抗菌活性和诱导细菌产生耐药性。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 标准菌株 以金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和化脓性链球菌(ATCC19615)作为抗菌活性测定的质控菌。临床菌株:分离于西南医院临床送检标本金黄色葡萄球菌临床菌株5株(Sau1～Sau5)和化脓性链球菌临床菌株5株(Spy1～Spy5)。

1.1.2 抗菌药物来源及配制 大环内酯类抗菌药物红霉素(ERY)、罗红霉素(ROX)、阿奇霉素(AZI)购自中国食品药品检定研究院。根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)2002年版抗菌药物药敏试验操作标准溶解并制备贮存液浓度为3 200 mg/L[7]。上述各药分别经孔径为0.22 μm滤膜过滤，将滤液分装于无菌小瓶中，-80 ℃保存，临用时用液体培养基配成所需应用液。

1.1.3 培养基 采用《中华人民共和国药典》2005年版2部,附录Ⅺ A抗菌药物微生物检定法,培养基用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH值(pH值分别为6.0、7.0、8.0)[8]。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 药物敏感性试验方法参见文献[9]，用不同pH值(6.0、7.0、8.0)的液体培养基稀释药物，各管中加入等量经临床分离的金黄色葡萄球菌(Sau1～Sau5)和化脓性链球菌接种菌液(Spy1～Spy5)以及标准菌种(浓度1×105CFU/mL)，置于37 ℃温箱孵育。每次试验设立阳性对照和阴性对照,每批试验重复3次，阳性对照管呈现良好生长即培养基颜色由红变黄，而阴性对照管无生长即颜色不变，药物试验管完全不能生长时的药物最低浓度为该药对金黄色葡萄球菌(Sau1～Sau5)和化脓性链球菌(Spy1～Spy5)的MIC。按照NCCLS 2000年规定的临界浓度判定每株对大环内酯类抗菌药物的敏感性。

1.2.2 自然产生耐药性 细菌以109～1010CFU/mL接种量涂布在含有2×MIC抗菌药物不同pH值(6.0、7.0、8.0)的琼脂平板上，37 ℃条件下培养过夜，观察自然产生耐药性的频率。

1.2.3 体外诱导产生耐药性 体外诱导耐药性产生的测定采用连续肉汤稀释法。采用2倍稀释法进行抗菌药物的稀释，使其最终浓度范围为0.01～1 024 mg/mL。细菌接种于含有不同浓度抗菌药物的pH值分别为6.0、7.0、8.0的M、H肉汤中，培养过夜。然后将肉眼可见细菌生长的最高药物浓度(即0.5×MIC)培养物以1∶20稀释后，再次转种到含不同浓度抗菌药物的pH值分别为6.0、7.0、8.0的M、H肉汤中，培养过夜，重复此转种步骤共7 d。完成连续转种后，取具有最高药物浓度的培养物传代培养在不含药物的pH值分别为6.0、7.0、8.0的琼脂平板上，以评估对抗菌药物耐药的稳定性。

2 结 果

2.1 大环内酯类药物pH的变化对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌MIC的影响 pH值的变化导致的大环内酯类对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的MIC结果如表1、2所示。结果表明，培养基pH值的降低导致大环内酯类MIC升高。罗红霉素和阿奇霉素的MIC升高超过10倍，其对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌的MIC达到了4.00～>64.00 mg/L。所有大环内酯类在碱性pH值条件下表现出最大的体外抗菌活性。

表1 在不同pH值条件下大环内酯类抗菌药物对金黄色葡萄球菌的MIC(mg/L)

表2 在不同pH值条件下大环内酯类抗菌药物对化脓性链球菌的MIC(mg/L)

表3 在不同pH值条件下金黄色葡萄球菌自然产生耐药性频率

2.2 金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的自然耐药频率 金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的自然耐药频率如表3、4所示。结果表明，金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药频率具有较强的pH依赖性。随着pH值的增加，金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药频率逐渐降低，在中性pH值条件下，耐药频率范围大约为1.1×10-7～9.7×10-6；但是在酸性条件下所有细菌都表现出耐药性。此外，与中性pH值相比，碱性培养基中生长的细菌其耐药频率降低了约10倍。

2.3 体外诱导金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药性 体外诱导金黄色葡萄球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药性如表5所示(化脓性链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药性的结果与金黄色葡萄球菌相似，结果未显示)。金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对大环内酯类药物都表现出高水平的耐药性。大环内酯类在6 d试验研究阶段中其MIC升高了16～133倍。MIC在所有试验pH条件下均有所增加，然而在酸性条件下MIC增加趋势比较明显。此外，在pH6.0时，阿奇霉素对金黄色葡萄球菌具有较高的MIC(>64.00 mg/L)。

表4 在不同pH值条件下化脓性链球菌自然产生耐药性频率

表5 两种细菌在不同pH值条件下体外诱导产生耐药性(mg/L)

3 讨 论

本研究采用肉汤稀释法检测在不同pH值条件下3种大环内酯类抗菌药物对金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的抗菌活性。结果表明，5株金黄色葡萄球菌和5株化脓性链球菌对3种大环内酯类抗菌药物的耐药性均表现出pH值依赖性，随着含有红霉素、罗红霉素和阿奇霉素的培养基pH值的增加，MCI逐渐降低。此外pH6.0升至pH8.0时，3种大环内酯类药物对细菌的MIC范围逐渐降低，其中罗红霉素和阿奇霉素的MIC降低至少10倍，即大环内酯类药物的抗菌活性随着pH的升高而增强，作者的研究结果与文献报道相一致[9-10]。

对于呼吸道感染病原菌，大环内酯类的MIC值随pH值的降低而增加，碱性pH条件下MIC值最低。大环内酯类在酸性环境中其MIC值增加了10倍。阿奇霉素在化学结构上因第2位碱基的存在，使其比其他大环内酯类更容易被离子化，因此阿奇霉素的MICs更易受到pH值的影响。由于pH值降低导致了MIC的显著增加，耐药表型也随之增加。在酸性环境中，所有细菌显示出耐药表型。其可能的作用机制为在酸性pH值条件下大环内酯类药物抗菌活性丢失。研究发现，大环内酯类抗菌药物不仅可通过5位上的氨基去氧糖与A2058靶点结合，其C-11、C-12氨基甲酸酯侧链还能与第2靶点A752结合，且结合力更强，从而发挥抗耐药菌活性[11]。方向群和刘又宁[12]研究表明罗红霉素能提高亚胺培南对生物被膜的渗透，从而增强其对生物被膜上铜绿假单胞菌的抑菌活性。体外诱导耐药突变试验表明，在pH值为6.0时所有细菌都诱导发展为中敏或耐药菌。这一现象与其他学者报道的数据相一致[13-15]。此外，酸性条件下细菌对大环内酯类的耐药性具有明显增加趋势。本研究表明，如果酸性环境能诱导体外细菌产生耐药性，那么也可能诱导呼吸道感染患者体内细菌的耐药性发展。因此，本研究评价酸性或碱性pH值对大环内酯类抗菌活性的影响对临床具有重要的指导意义。

人体血液pH为7.35～7.45，体外金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌生长的最适pH值为7.8～8.0，大环内酯类MIC最小的pH为8.0，三者差异较大。而pH值对大环内酯类药物抗金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌活性影响较大，所以体外药敏试验选择金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌生长的最适pH值时，既要保证肺金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌生长又要尽量模仿体内条件以检测到药物真实的抗菌效果，同时还要考虑药物在体内的抗菌活性和代谢产物对酸碱度的影响。故认为金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌体外药敏试验的液体培养基pH值7.5较为合适，金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌在肉汤中生长不形成浑浊，对营养要求苛刻，难于定量对药敏试验的准确性影响较大。最适pH值的确定或许可为金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌体外药敏试验的标准化提供了1项参考指标。

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Effect of different pH on antibacterial activity and drug resistance of macrolide antibiotics

GAOHui-li1,LUOGuang-ming2△

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofRespiration,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To investigate the effect of staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes on the drug resistance and the minimal inhibition concentration (MIC) of macrolide antibiotics under the different pH value conditions.Methods The broth dilution method was used to detect the drug resistance and MIC of macrolide antibiotics to clinically isolated staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes.Results The drug resistance and MIC of macrolide antibiotics to staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes were decreased with enhance of pH value in certainly dose-dependent manner.In addition,the inhibition activity of roxithromycin and azithromycin were stronger than that of erythromycin.The in vitro study indicated that the MIC values were increased in all the experiment pH conditions,but the MIC values gradually were decreased with augment of pH values.Conclusion The MIC values of macrolide antibiotics are gradually decreased with augment of pH values in culture medium,and macrolide antibiotics can improve the antibacterial activity of staphylococcus aureus and streptococcus pyogenes in certain pH values condition.

macrolides; antibacterial activity; bacterial resistance; pH values

高慧莉，女，大专，药师，主要从事临床药学研究。△

,E-mail:lgming@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.017

A

1672-9455(2015)18-2690-04

2015-03-25

2015-04-18)