不同大孔吸附树脂对葛根总黄酮分离纯化效果的影响*

王海峰，张 红

1武警工程大学医院，陕西 西安 710086；2陕西省中医药研究院

不同大孔吸附树脂对葛根总黄酮分离纯化效果的影响*

王海峰1，张 红2

1武警工程大学医院，陕西 西安 710086；2陕西省中医药研究院

目的：考察三种大孔吸附树脂对葛根总黄酮的吸附及解吸性能，为分离纯化葛根总黄酮提供选择依据。方法：以葛根总黄酮为筛选指标，考察A B-8、N K A和X-5三种大孔树脂对葛根总黄酮的吸附量和解吸率。结果：以A B-8树脂为吸附剂。最佳分离条件为上样浓度：1 g/m L(按生药计算)，流速：2～3 m L/m i n，70%乙醇为洗脱剂，用量为2.5 BV，总黄酮得率76.22%。结果：A B-8大孔吸附树脂可用于分离纯化葛根总黄酮，总黄酮得率76.22%。结论：三种大孔吸附树脂相比较，以A B-8为分离纯化葛根总黄酮的最佳吸附剂。

葛根总黄酮；葛根素；大孔吸附树脂

葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)是豆科落叶藤本植物野葛根，最早载于《神农本草经》，性平，味甘辛，功效解肌退热，生津止渴，升阳透疹［1］。药理研究发现葛根具有抗缺氧，改善脑循环，保护心肌缺血，降血压等作用［1-4］。临床主要用于急性脑梗塞，急性心肌梗塞，不稳定性心绞痛，高粘血症的治疗［5-8］。葛根含黄酮类化合物高达7.6%，主要有葛根素、大豆素、大豆素4′，7-二葡萄糖苷黄豆苷等［9-10］。本研究采用葛根70%乙醇回流得到粗提液为原料，比较AB-8、NKA-9和X-5三种大孔吸附树脂对葛根总黄酮的分离效果，并考察AB-8大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺和方法。

1 材料与方法

1.1 材料 葛根采自陕西省安康市镇平县。葛根素标准品购于中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511；AB-8、NKA及X-5大孔吸附树脂购于天津南开大学化工厂；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器 UV-2201型紫外分光光度计；层析柱(φ15 mm×200 cm)。

1.3 方法

1.3.1 葛根粗提液制备 将葛根药材(300 g)烘干，粉碎成粗粉，采用30%乙醇为溶剂回流提取3次，1.5h/次，滤过，滤液合并，减压浓缩至300mL，得到葛根粗提液。

1.3.2 葛根总黄酮含量测定 以葛根素为对照品，采用紫外分光光度法测定葛根总黄酮含量。

1.3.2.1 标准曲线的绘制 精密称取葛根素4.88 mg，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液(含葛根素0.1952mg/mL)。精密量取储备液 0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mL，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇稀至刻度，摇匀。分别于254 nm波长处测定吸光度，并建立浓度对吸光度的线性回归方程：A=62.216C+ 0.0043；相关系数r=0.999 7，见图1。

图1 标准曲线

1.3.2.2 含量测定 取葛根粗提液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀。另取1.0 mL乙醇同法稀释作空白对照，在254 nm波长处测定吸光度。计算葛根总黄酮的含量，结果为3.997 mg/mL。

1.3.3 3种大孔吸附树脂吸附性能的比较(柱层析分离纯化)

1.3.3.1 大孔吸附树脂预处理 AB-8、NKA和X-5 3种树脂各取100 g，加95%乙醇适量，浸泡3天，让树脂充分溶胀，然后用95%乙醇洗脱至流出液中加水后无白色浑浊出现，再用蒸馏水洗尽乙醇，备用。

1.3.3.2 吸附量与解吸率测定 精密称取预处理过的树脂5 g，置于三角瓶中，精密加入葛根粗提液50 mL，振荡24小时，滤过，测定滤液中总黄酮浓度。计算3种树脂的吸附量和吸附率。再向吸附的树脂中精密加入95%乙醇50 mL，振荡24小时，滤过，测定滤液中总黄酮浓度，根据总黄酮解吸量计算解吸率。

2 结果

2.1 吸附量与解吸率测定结果 标准曲线的建立以“1.3.2.1”项下方法绘制标准曲线，建立总黄酮浓度对吸光度的线性回归方程：A=66.163C+ 0.043 5；r=0.999 5，计算吸附量和解吸率。实验结果可见3种树脂中，AB-8大孔树脂对葛根总黄酮的吸附量和解吸率最大，见表1。

表1 3种树脂对葛根总黄酮的吸附量与解吸率测定 m g

2.2 A B-8大孔树脂对葛根总黄酮的分离纯化

2.2.1 吸附流速对吸附效果的影响 吸附流速对吸附效果的影响主要是影响溶质向树脂表面的扩散。如果流速太高，溶质分子来不及扩散到树脂表面，就会发生漏过。对相同的葛根浸提液(50mL)在相同条件下，分别进行了AB-8树脂在吸附流速为小流速(2～3 mL/min)，中档流速(4～5 mL/min)、最高流速(6～7 mL/min)的吸附实验，结果表明流速为2～3 mL/min时黄酮洗脱量最大，见表2。

表2 吸附流速对吸附效果的影响

2.2.2 洗脱剂及洗脱浓度的选择 取AB-8树脂，湿法装柱(径高比1∶15)，准确吸取50 mL样品原液，以流速1 mL/min上柱，分别准确配制30%、50%、70%、80%和90%的乙醇洗脱剂，检测它们在相同条件下通过树脂柱时的解吸率，实验发现70%以下乙醇洗脱曲线光滑，无拖尾，其解吸率适中，因此选用70%乙醇洗脱，见表3，洗脱曲线见图2。

表3 不同浓度乙醇洗脱剂对吸附效果的影响

2.2.3 洗脱剂用量的选择 用AB-8大孔树脂(树脂体积25 mL)饱和吸附葛根粗提液，分别用60、90、120、150、180、200、240、270 mL 70%的乙醇洗脱，收集每一树脂流出液体积，计算黄酮洗脱率，依据累积洗脱率确定70%乙醇用量，见表4。

表4 洗脱剂用量考察结果

实验发现当洗脱剂用量大于8倍树脂体积得到的黄酮量少，因70%乙醇用量是树脂体积5倍时洗脱率累积达到76.22%，说明此时大孔树脂吸附的黄酮已基本被洗脱下来，并且在其用量为4倍树脂体积时洗脱率为58.55%。当70%乙醇用量为树脂体积5～8倍时，黄酮洗脱率的累积值较小，说明70%乙醇用量大于5倍树脂体积得到的黄酮量少，因此确定体积分数70%乙醇的最适宜用量为5倍树脂体积。

图2 不同浓度乙醇洗脱剂的洗脱曲线

3 结论

大孔树脂(macroporous resin)是以苯乙烯和丙酸酯为单体，加入乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，经聚合反应制备而成。聚合物形成后，除去致孔剂，树脂中留下了大小不一、形状各异、互相贯通的孔洞。是分离中草药水溶性成分的一种有效方法［11］。

3种树脂中AB-8对葛根总黄酮和葛根素具有较高的吸附量，对葛根总黄酮的解吸率超过75%，可用于葛根总黄酮的分离纯化。通过动态吸附、解吸的方法，以总黄酮吸附率和解吸率为评价指标，对AB-8大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮效果影响的最佳条件为：以70%乙醇为洗脱剂、用量为树脂体积的5倍，吸附流速2～3 mL/min。葛根总黄酮收率为76.22%，表明AB-8大孔树脂纯化法能够富集葛根黄酮，适合于葛根黄酮的纯化。

［1］ 徐国钧，何宏贤.中国药材学［M］.北京:中国医药科技出版社，1996:249.

［2］ 韦正友，汤泉，焦东桂，等.葛根素对常压密闭条件下小鼠的抗缺氧作用［J］.基层中药杂志，1997，11(4):43-44.

［3］ 刘启功，王琳.葛根素对心肌梗塞犬冠脉侧枝循环的影响［J］.中国中药杂志，1999，24(5):304-306.

［4］ 黄兆铨，叶武.葛根素对高血压患者血浆内皮素和一氧化氮的影响［J］.中国现代应用药学杂志，1999，16(3):13-15.

［5］ 马琳，何娅.葛根素注射液治疗急性脑梗塞68例［J］.陕西中医，1999，20(1):11.

［6］ 李淑梅，刘斌，陈海芬，等.葛根素注射液对急性心肌梗塞患者血浆内皮素及肾素血管紧张素系统的影响［J］.中国中西医结合杂志，1997，17(6):339-341.

［7］ 赵志明，杨晓英.葛根素治疗不稳定性心绞痛的临床研究［J］.中国中西医结合杂志，1998，18(5):282-284.

［8］ 刘艳娟，吴汉卿.葛根素注射液治疗高粘血症的临床观察［J］.中国中医药科技，1999，6(2):115-116.

［9］ 许永兴，瞿海斌，陈赟.葛根素大孔吸附树脂层析分离动力学［J］.高校化学工程学报，2005，19(6):29-34.

［10］马振山.大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用［J］.中成药，1997，19(12):40-41.

［11］李剑君，李稳高，高新，等.A B-8型大孔吸附树脂吸附葛根素过程的研究［J］.西安交通大学学报，2000，34(4):78-81.

Influence of Macroporous Adsorption Resin on Purification of Total Flavonoids from GeGen

WANG Haifeng1,ZHANG Hong2
1 Hospital Affiliated to Engineering University of CAPF,Xi′an 710086,China;
2 Shaanxi Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide reference for purifying total flavonoids from GeGen［Puerariae lobata(Willd.) ohwi］by observing adsorption and desorption of macroporous absorption resin to total flavonoids from GeGen. Methods:By taking total flavonoids from GeGen as screening index,adsorption volume and desorption rate of total flavonoids from GeGen were investigated by three kinds of macroporous adsorption resins AB-8,NKA and X-5.Results:AB-8 resin was taken as adsorbent.The optimal separation conditions were sample concentrations:1 g/mL(calculated according to crude drugs),flow rate:2～3 mL/min,70%ethanol as eluent,dosage:2.5BV,total flavonoids yield was 76.22%.Conclusion:AB-8 is chosen as the best adsorbent of separating and purifying total flavonoids from GeGen after comparing three kinds of macroporous absorption resins.

total flavonoids from GeGen;puerarin;macroporous absorption resin

R567.1

A

1004-6852(2015)11-0027-03

2014-11-29

西安市科技计划项目［编号 SF0931(1)］。

王海峰(1976—)，男，主管药师。研究方向：中药药剂学。