蚂蟥药材的指纹图谱研究*

刘 君，张丽艳

1辽宁省中医药研究院中药炮制研究室，辽宁 沈阳110034；2辽宁中医药大学基础医学院

蚂蟥药材的指纹图谱研究*

刘 君1，张丽艳2

1辽宁省中医药研究院中药炮制研究室，辽宁 沈阳110034；2辽宁中医药大学基础医学院

目的：研究蚂蟥药材的指纹图谱。方法：采用SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离蚂蟥药材提取物中的蛋白质类成分，采用凝胶图像处理系统进行分析。结果：电泳图谱清晰，指纹图谱共有条带10条，非共有峰面积＜10%，经方法学考察，RSD%均小于3%。结论：方法稳定，可靠，且重现性良好。

水蛭；蚂蟥；指纹图谱

蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)，为水蛭科动物蚂蟥的干燥全体，又叫宽体金钱蛭，是一味经典的破血逐瘀药，其药性咸、苦、平，有小毒，归肝经。蚂蟥具有破血通经，逐瘀消癥之效，临床用于治疗血滞经闭，癥瘕积聚，跌打损伤等瘀血阻滞之症［1］。蚂蟥是《中国药典》一部(2010版)收载的中药水蛭的3个品种之一。蚂蟥主产于中国，在临床上应用广泛，为水蛭药用的主流品种［2］。许多研究资料表明，中药水蛭中主要的活血作用为抗凝血，而其抗凝血的主要成分为多肽及蛋白质类［3］。而笔者前期研究结果表明，蚂蟥水溶性成分具有良好的抗凝血作用。本研究采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对蚂蟥药材提取物中蛋白类成分进行有效的分析分离，并进行指纹图谱研究，对蚂蟥药材的质量标准研究提供研究方法，为其药材的合理使用及开发提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 蚂蟥药材 购于江苏沛县，经中国海洋生物研究所鉴定为蚂蟥。本实验采用干品药材，系10月份捕捉后洗净，用沸水烫死，晒干或低温干燥，备用。

1.2 M H-3对照品 为从中药蚂蟥中提取出来的蛋白质单体，为本实验室自制，经采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其相对分子量约为15580Da。

1.3 试剂 所有试剂皆为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 指纹图谱 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

1.4.2 供试品制备 取蚂蟥药材，粉碎，取粉末1 g，精密称定，加入蒸馏水50 mL，置匀浆器中匀浆，放置过夜，冷藏(-4℃)，离心，取上清液定容于100 mL量瓶中备用。

1.4.3 对照品溶液的制备 精密称取MH-3冻干粉，加重蒸馏水制成每1 mL含100 μg的溶液，备用。

1.4.4 电泳条件及系统适用性试验 仪器：DYYIII-24A型垂直板凝胶电泳槽；ECP-3000型三恒电泳仪，由北京六一仪器厂提供，Kodak 265变焦数码相机为美国伊士曼柯达公司提供GIS-700D凝胶图象处理系统，由上海天能科技有限公司提供。

1.4.5 测定方法 精密吸取供试品溶液20 μL，对照品10 μL分别加入凝胶板加样孔中，分离胶浓度：12.5%；浓缩胶浓度：5%。电流恒定在16 mA，待指示剂距前沿约1 cm时，停止电泳，取出，固定，染色，得电泳胶片。用GIS-700D凝胶图象处理系统测定各条带的迁移率及条带面积，电泳图谱如下：

图1 蚂蟥药材的电泳指纹图谱

图2 蚂蟥药材电泳指纹图谱的条带号

1.4.6 指纹图谱 药材指纹图谱技术参数见表1—2。

表1 蚂蟥药材标准指纹图谱相对迁移率

表2 蚂蟥药材电泳标准指纹图谱相对条带面积

蚂蟥药材指纹图谱共有条带10条，供试品指纹图谱中与参照物MH-3相应的条带为9号，将其作为内标物，非共有峰面积＜10%。

1.4.7 方法学考察

1.4.7.1 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时内按以上方法检测，结果表明，其相对迁移率RSD%在0.22%～2.96%之间，相对条带面积RSD%在0.31%～1.09%之间。说明在12小时内测定，稳定性试验良好。

1.4.7.2 精密度试验 取同一供试品溶液，连续5次进行测定，其相对迁移率RSD%在0.27%～2.02%之间，相对条带面积RSD%在0.35%～1.67%之间。结果表明仪器的精密度试验良好。

1.4.7.3 重现性试验 取同一批号供试品5份，分别按以上方法测定，其相对迁移率RSD%在0.39%～1.89%之间，相对条带面积RSD%在0.62%～1.74%之间。结果表明，本实验方法的重现性良好［4］。

1.4.8 药材测定 取固定产地(江苏沛县)，固定捕捉时间(10月份)，加工方法固定的10批蚂蟥药材进行指纹图谱测定，其相对迁移率及相对条带面积见表3—4。

3 讨论

本实验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，以本实验室自行提取的蚂蟥中的蛋白质单体MH-3作为内标物，对蚂蟥药材进行电泳指纹图谱研究，其图谱清晰，指纹图谱共有条带10条，非共有峰面积＜10%，经方法学考察，RSD%均小于3%，方法稳定，可靠，而且重现性良好。

表3 10批药材指纹图谱相对迁移率

表4 10批药材指纹图谱相对条带面积

对动物药指纹图谱的研究是一个值得关注的领域，本研究采用蛋白质电泳指纹图谱技术，建立蚂蟥药材中蛋白类成分的指纹图谱，这种方法利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术，可以将微量的蛋白质检测出来，该方法较为简单、快速、可靠，而且费用较低，为蚂蟥药材的指纹图谱研究建立了一种新的方法，也为动物药指纹图谱的研究提供新思路。

［1］ 王蒙萌.水蛭的化学成分及药理作用［J］.黑龙江中医药，2008(2)：47-48.

［2］ 瞿新燕.水蛭的抗凝血作用研究［J］.现代中西医结合杂志，2010，19(13)：1582-1583.

［3］ 李艳玲，赵建平.水蛭化学成分的分离及分析概述［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11(9)：43-44.

［4］ 袁晓环，杨旭东，崔荣君，等.水蛭注射液的H PLC指纹图谱［J］.中国医药工业杂志，2008，39(7)：530-532.

Study on Fingerprint of Leech

LIU Jun1,ZHANG Liyan2
1 Chinese Materia Medica Processing Lab of Liaoning Academy of Chinese Medicine,Shenyang 110034,China;
2 Basic Medical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Objective:To study the fingerprint of leech(Whitmania pigra Whitman).Methods:Albumin ingredients of leech extracts were abstracted by adopting SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),and analyzed by gel imaging processing system.Results:Electrophorogram was clear,there were ten bands in the fingerprints,uncommon peak area＜10%,RSD%was less than 3%after investigated by the methodology.Conclusion: The method is stable,reliable and reproducible.

leech;MaHuang;fingerprint

R284.1

A

1004-6852(2015)10-0040-03

2014-10-27

辽宁省教育厅科学技术研究项目(编号2006B058)。

刘君(1971—)，女，博士学位，副研究员。研究方向：中药药效物质基础的研究。