微波辅助甲酯化-快速GC 法测定烟草中的多元酸和高级脂肪酸

朱 玲，郑 健，杨 涓，安泓汋，王 晶，龙 君，朱立军

川渝中烟工业有限责任公司技术研发中心，成都市锦江区成龙大道56号 610066

微波辅助甲酯化-快速GC 法测定烟草中的多元酸和高级脂肪酸

朱 玲，郑 健，杨 涓，安泓汋，王 晶，龙 君，朱立军*

川渝中烟工业有限责任公司技术研发中心，成都市锦江区成龙大道56号 610066

建立了同时检测烟草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸）和高级脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸和亚油酸）的微波辅助甲酯化-快速气相色谱（GC）分析方法，并测定了烤烟及雪茄烟各10个烟叶样品中的多元酸和高级脂肪酸含量（质量分数）。结果表明：①最优前处理条件为衍生化试剂10%硫酸-甲醇溶液，微波功率以20W/s的速率升高至1200W（保持1 m in），萃取剂二氯甲烷。②快速GC分析时间为8．81m in，目标化合物标准曲线线性良好（r2＞0．99），加标回收率在83．18%～114．17%之间，精密度（RSD）小于5%。③烤烟烟叶和雪茄烟烟叶中有机酸含量差异较大，其中烤烟烟叶中多元酸（除苹果酸外）含量低于雪茄烟烟叶，高级脂肪酸（除硬脂酸外）含量高于雪茄烟烟叶。该方法快速、准确，适用于测定烟草中的多元酸和高级脂肪酸含量。

烟草；微波辅助甲酯化；快速气相色谱（GC）；多元酸；高级脂肪酸

烟草中的非挥发性多元酸和高级脂肪酸占烟叶质量的10%左右，其种类和含量是影响烟叶品质的重要因素之一［1］。多元酸能与生物碱结合成盐，调节质子化和游离态烟碱比例，从而影响烟叶的劲头和吸味，其中苹果酸、柠檬酸、草酸等多元酸还是卷烟加料的常用成分，可以调节卷烟烟气pH、增加烟气浓度、改善吸味、使烟气醇和［2］。饱和高级脂肪酸会增加烟气的脂肪或蜡味，亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸则会增加刺激性［3］。因此，分析多元酸和高级脂肪酸的种类及含量对了解烟叶的内在质量和改进卷烟配方具有重要的指导意义。目前，多元酸和高级脂肪酸的检测常用硫酸-甲醇作为衍生化试剂直接甲酯化，然后进行气相色谱(GC)分析［1,3-7］。由于甲酯化反应大多采用室温静置或加热回流的方法，GC法主要使用常规色谱柱，因而存在甲酯化反应及色谱分析样品耗时长、操作繁琐、检测效率较低等问题。微波加热具有渗透力强、升温速率快、加热效率高等特性［8-9］，能显著提高有机酸的提取和酯化效率；快速GC采用微孔毛细管短柱，能显著缩短色谱分析时间［10］，适合大量样品的快速分析。因此，建立了微波辅助甲酯化-快速GC测定烟草中多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸）和高级脂肪酸（棕榈酸、硬脂酸和亚油酸）的分析方法，旨在为烟草中多元酸和高级脂肪酸的快速检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

国内外烤烟及雪茄烟烟叶样品各10个，均由川渝中烟工业有限责任公司技术研发中心提供。其中烤烟烟叶样品生产年份均为2012年，雪茄烟烟叶样品为2009—2011年。

二氯甲烷（色谱纯，美国Fisher Chemical公司）；甲醇、硫酸（AR，国药集团化学试剂有限公司）。草酸（美国Sigma-Aldrich公司），丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、一水合柠檬酸（国药集团化学试剂有限公司），己二酸（内标，日本TCI公司），硬脂酸（瑞士Fluka公司），棕榈酸（德国Merck公司），亚油酸（比利时Acros公司），以上标样纯度均大于98%。

HP6890型气相色谱/HP5973质谱仪（美国Agilent公司）；Multiwave PRO微波样品制备仪（奥地利Anton Paar公司）；MS204S电子天平（感量：0.000 1g，瑞士Mettler Toledo公司）；3K-15离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q Direct 16纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 标准工作溶液的配制

内标溶液：取1.60 g己二酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，配制一级内标储备液；取一级内标储备液10mL，用甲醇稀释至100m L，得到二级内标溶液，于4℃冰箱中保存。

系列标准工作溶液：准确称取2.50 g苹果酸、2.50 g柠檬酸、0.60 g丙二酸、0.10 g反丁烯二酸、0.10 g棕榈酸、0.10 g亚油酸、0.03 g琥珀酸、6.55 g苹果酸和0.02 g硬脂酸，于100mL容量瓶中用甲醇定容，得到有机酸混合标准储备液；分别移取0.25、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0mL有机酸混合标准储备液于7只25mL容量瓶中，加入2.5mL一级内标储备液后用甲醇定容，得到有机酸系列标准工作溶液，于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2 衍生化试剂的配制

衍生化试剂为硫酸-甲醇溶液，反应时加入己二酸（内标）的甲醇溶液用于内标法定量分析。硫酸-甲醇溶液比例均表示为1.5体积硫酸-甲醇溶液和1体积内标甲醇溶液混合后硫酸的终含量（体积分数）。根据比例分别配制得到硫酸终含量为1%、2%、4%、6%、8%、10%和12%的硫酸-甲醇溶液。

1.2.2 样品预处理及衍生化

将烟叶抽去烟梗，40℃下干燥2 h，粉碎，过0.42 mm（40目）筛备用。采用行业标准方法测定烟叶含水率［11］。取0.1 g烟末于50mL微波反应管中，依次加入1mL二级内标溶液和1.5 mL硫酸-甲醇溶液（硫酸含量10%），24管同时进行微波辅助衍生化处理，微波功率以20 W/s的速率升高至1 200W，并保持1 min；反应毕，冷却至室温，加入5mL水和3mL二氯甲烷，充分振荡萃取，置于离心管中以5 000 r/min速率离心8 min；取上清液，过滤后进行快速GC-FID和GC-MS分析。分析条件为：

色谱柱：DB-17熔融石英毛细管柱（10 m× 0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）；进样口温度：250℃；载气：He，0.4mL/min；进样量：1μL，分流比187∶1；升温程序：；FID 检测器温度：275℃；H2：40mL/min；空气：450mL/m in；He：30mL/min；信号采集频率：100 Hz；MS传输线温度：280℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI；电离能量：70 eV；扫描范围：35～450 amu。

完全出露型孤石与叠孤石公式相同，但稳定性并不相同，从公式(3)看，抗滑移能力主要与各自的摩擦系数有关，摩擦系数越大，抗滑移能力也就越强。由于完全出露孤石无悬空部分，所以完全出露型孤石与叠孤石相比不存在中心外移情况，公式(4)中x值也就更大，抗倾覆能力也就更好。故完全出露的孤石抗滑性由孤石与坡面的摩擦系数决定，抗倾覆性优于叠孤石。

1.2.3 数据处理与分析

采用NIST数据库检索及标准品对照定性各化合物，对没有标准品的化合物根据文献报道及NIST数据库检索结果定性；内标法定量分析。应用SPSS软件对烤烟及雪茄烟烟叶中多元酸和高级脂肪酸的测定结果进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 硫酸-甲醇比例的选择

有机酸衍生化常采用硫酸-甲醇作为衍生化试剂，通过酸性条件下有机酸的酯化反应和酯交换反应，使有机酸转化为挥发性的有机酸甲酯［5］。在本研究中，分别采用硫酸含量为0、1%、2%、4%、6%、8%、10%及12%的硫酸-甲醇作为衍生化试剂筛选最优的硫酸-甲醇比例，进行3次平行实验。结果（图1）显示，在相同的微波反应条件下，随着硫酸含量的增加，各有机酸的色谱峰面积明显增加，表明硫酸比例对有机酸的酯化程度有较大的影响，苹果酸和己二酸（内标）在硫酸含量为2%时基本反应完全，而大多数有机酸在硫酸含量为10%时均反应完全，当硫酸含量继续增加时，棕榈酸、亚油酸峰面积小，因此选择10%硫酸-甲醇溶液作为衍生化试剂。

2.1.2 微波条件的优化

2.1.3 萃取剂的选择

有机酸衍生物的常用萃取溶剂有二氯甲烷、正己烷、正戊烷、乙酸乙酯等［4-5,12］，因此选择这4种溶剂进行了考察。结果发现：二氯甲烷萃取快速且效率高；乙酸乙酯萃取过程中部分样品发生乳化难以分层；正己烷、正戊烷萃取率较低。因此选择二氯甲烷作为萃取溶剂。

图1 硫酸-甲醇比例对烟叶中多元酸和高级脂肪酸测定结果的影响

2.2 色谱条件的选择

有机酸的检测多采用DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色谱柱［1,13］及与其性质相近的HPU ltra 2色谱柱［4］，但此类色谱柱无法完全分离分子结构和极性均相近的油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯，且分析时间长（通常超过1 h）。据文献［14］报道，DB-17（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）色谱柱能有效分离油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯。为提高分析效率、缩短检测时间，选用内径更小、柱长更短的DB-17（10 m×0.10 mm i.d.×0.10μm d.f.）色谱柱进行快速GC分析。结果（图3）显示，采用DB-17微孔短柱分离时，可以实现硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯及亚麻酸甲酯的分离，且色谱峰峰型较好，色谱分析时间仅需8.81min。

图2 微波条件对烟叶中多元酸和高级脂肪酸测定结果的影响

图3 多元酸和高级脂肪酸的标准溶液和样品色谱图

2.3 烟叶中多元酸和高级脂肪酸的定性结果

分别对标准溶液、烤烟及雪茄烟样品进行GC-FID和GC-MS分析，色谱峰定性结果如图3所示。其中没有标准品的化合物定性结果如表1所示，表明烤烟和雪茄烟烟叶样品中均含有油酸和亚麻酸［4,15］，另外此方法还能检测到一定量的4-氧代-戊酸［16-17］和2,4-庚二烯酸［18-19］。

2.4 工作曲线和检测限

分别对7个不同质量浓度的多元酸和高级脂肪酸的混合标准溶液进行微波辅助衍生化和快速GC分析，采用内标法定量，以各有机酸与相应内标的峰面积比（Y）对其相应浓度比（X）进行回归分析，得到各有机酸的回归方程及其相关系数（表2）。由表2可知，各多元酸和高级脂肪酸标准曲线的线性关系良好，相关系数r2均大于0.99。将最低浓度的标准溶液稀释并进行快速GC分析，以3倍信噪比为方法的检出限（LOD），结果（表2）表明本方法具有较高的灵敏度，适合于定量分析。

表1 烟叶样品部分有机酸的定性结果

表2 多元酸和高级脂肪酸的工作曲线、相关系数、LOD、回收率和精密度 （n=6）

2.5 回收率与精密度

分别以烤烟和雪茄烟作为分析对象进行精密度实验，重复测定6次，计算平行测定结果的相对标准偏差（RSD）。采用标准加入法测定方法的回收率，取烤烟和雪茄烟样品各1个，进行低、中、高3种不同浓度水平的加标处理，衍生化后进行快速GC分析，计算其加标回收率。结果（表2）显示：加标回收率为83.18%～114.17%，RSD为1.59%～4.93%，说明本方法的准确性和重复性均较好，可以满足定量需要。

2.6 与传统方法测定结果的比较

通常，有机酸和不饱和脂肪酸分析方法中衍生化时间为22～24 h，样品分析时间为65 m in［3-4］，而采用本方法可同时微波辅助衍生化24个样品，时间为2min，样品色谱分析时间仅8.81 min，检测效率大幅提升。对本方法和传统方法［4］测定结果（表3）进行配对T检验，结果显示，采用本方法的测定结果与采用传统方法的测定结果无显著差异（P＞0.05），且与文献报道［4,6,20-21］的烟叶样品中多元酸和高级脂肪酸的含量范围一致。

表3 本方法与传统方法测定结果的比较 （mg·g-1）

2.7 样品分析结果

采用本方法分别测定了10个烤烟和10个雪茄烟烟叶样品，结果如表4和表5所示。对烤烟烟叶和雪茄烟烟叶中多元酸和高级脂肪酸含量进行独立样品T检验。结果表明，不同烟叶样品中多元酸和高级脂肪酸含量差异较大，其中雪茄烟烟叶中的多元酸含量（除苹果酸外）显著高于烤烟烟叶（P＜0.05），尤其是草酸和柠檬酸；而烤烟烟叶中高级脂肪酸（除硬脂酸外）含量显著高于雪茄烟烟叶（P＜0.05）。

表4 烤烟烟叶中多元酸和高级脂肪酸含量① （mg·g-1）

表5 雪茄烟烟叶中多元酸和高级脂肪酸含量 （mg·g-1）

3 结论

建立了微波辅助甲酯化-快速气相色谱分析烟草中多元酸和高级脂肪酸含量的方法，本方法样品前处理简单快速、检测灵敏度高、结果准确可靠，适用于烟草样品中多元酸和高级脂肪酸的快速检测。烤烟和雪茄烟烟叶中的有机酸含量差异较大，烤烟烟叶中的多元酸（草酸、丙二酸、反丁烯二酸、琥珀酸及柠檬酸）含量明显低于雪茄烟烟叶，高级脂肪酸（棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸）含量明显高于雪茄烟烟叶。

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责任编辑 洪广峰

Determination of Polybasic Acids and Higher Fatty Acids in Tobacco by Microwave-assisted Methyl Esterification Combining with Fast GC

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,AN Hongyue,WANG Jing,LONG Jun,and ZHU Lijun*
Research&Development Center,China Tobacco Chuanyu Industrial Co.,Ltd.,Chengdu 610066,China

A method combining m icrowave-assisted derivatization with fast gas chromatography(GC)was developed for rapidly determ ining the contents of polybasic acids(oxalic acid,malonic acid,fumaric acid, succinic acid,malic acid and citric acid)and higher fatty acids(palm itic acid,stearic acid and linoleic acid)intobacco,and the contents of these acids inten flue-cured tobacco samples and ten cigar filler tobacco sam ples were determ ined.The resu lts showed that：1)The op timal pretreatment conditions were using 10%sulfuric acid-methanol as esterification reagent and CH2Cl2as extraction agent while the power of m icrowave increased at a rate of 20 W/s to 1200 W(remaining for 1 m in).2)The time for fast GC analysis was 8.81 m in,the calibration curves of target com pounds displayed good linearity(r2＞0.99),the standard addition recoveries ranged from 83.18%to 114.17%with RSD less than 5%.3)The contents of organic acids in flue-cured tobacco and cigar filler tobacco were quite different,the contents of polybasic acids(excluding malic acid)were higher in cigar filler tobacco,while the contents of higher fatty acids (excluding stearic acid)were higher in flue-cured tobacco.This method is rapid,accurate and suitable for the determ ination of po lybasic acids and higher fatty acids intobacco.

Tobacco;Microwave-assisted methyl esterification;Fast GC;Polybasic acid;Higher fatty acid

TS411.1

A

1002-0861（2015）09-0056-07

10.16135/j.issn1002-0861.20150910

2014-11-21

2015-04-17

四川省科学技术厅基金项目“光谱分析技术在卷烟主要辅助材料质量监控中的应用研究”（2013JYZ004）。

朱玲（1987—），女，硕士，助理工程师，主要从事烟草化学分析研究。E-mail：zhuling@cytobacco.com；*

朱立军，E-mail：zhulj7802@163.com

朱玲，郑健，杨涓，等.微波辅助甲酯化-快速GC法测定烟草中的多元酸和高级脂肪酸［J］.烟草科技，2015，48（9）：56-61，74.

ZHU Ling,ZHENG Jian,YANG Juan,etal.Determ ination of polybasic acids and higher fatty acids in tobacco by m icrowave-assisted methyl esterification combining with fast GC［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：56-61，74.