气相色谱-串联质谱法同时检测卷烟主流烟气中的苯并[a]芘和NNK

陈晓水，汤晓东，张博，蒋佳磊，朱书秀，陆明华

浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州市西湖区转塘镇科海路118号 310024

气相色谱-串联质谱法同时检测卷烟主流烟气中的苯并[a]芘和NNK

陈晓水，汤晓东，张博，蒋佳磊，朱书秀，陆明华*

浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州市西湖区转塘镇科海路118号 310024

建立了同时测定卷烟主流烟气中苯并[a]芘（BaP）和4-(N-甲基-N-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）方法。用剑桥滤片捕集卷烟主流烟气粒相物后再用甲苯进行振荡萃取，萃取液经过基质分散固相萃取净化及氮吹浓缩后采用DB-35MS色谱柱分离、多反应监测（MRM）模式分析，内标法定量。结果表明：①NNK和BaP的定量限、加标回收率、相对标准偏差（RSD）分别为0．36和0．29 ng/支，78．8%～95．5%和101．6%～106．6%，2．3%～15．4%和2．9%～14．4%。②与标准方法相比，该方法前处理简单，可实现两种目标物的同时测定。③采用该方法与现有标准方法对27个卷烟的检测结果显示两组数据的一致性较好，无显著性差异。该方法操作简单、结果准确，适用于同时分析卷烟主流烟气中NNK和BaP的释放量。

卷烟;苯并[a]芘（BaP）；4-(N-甲基-N-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）；气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）

Keywords：Cigarette;Benzo[a]pyrene(BaP);4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridy l)-1-butanone(NNK); Gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)

多环芳烃（PA Hs）和烟草特有N-亚硝胺（TSN As）是卷烟主流烟气中的两类主要有害物质［1］，其中最具代表性的是BaP和NNK［2］，准确测定卷烟主流烟气中BaP和NNK的释放量对正确评估卷烟危害性具有重要意义。关于卷烟主流烟气中BaP和NNK的检测，现有的国家标准中采用了两种不同的方法：GB/T 21130—2007［3］和GB/T 23228—2008［4］。据文献报道，主流烟气中NNK的测定方法主要有GC-TEA［3］和LC-MS/MS［5-8］，GC/MS［9］和GC-MS/MS［10］；BaP的主要测定方法有GC/MS［11］，HPLC［12-13］和GC-MS/MS［14-15］。目前GC-MS/MS在单独分析NNK或BaP的研究中均已得到了应用，但由于两种物质的极性差别较大，且在卷烟主流烟气中的释放量水平均为ng/支，同时检测上述两种目标物的研究尚未见报道。因此，对样品前处理条件进行了考察优化，旨在建立一种同时分析卷烟主流烟气中BaP和NNK释放量的GC-MS/MS方法，提高分析通量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

27个卷烟样品为2012年卷烟市场抽查样品，其中烤烟型卷烟样品20个（1～20号），混合型卷烟样品7个（21～27号），由国家烟草质量监督检验中心提供。

BaP、NNK、BaP-d12、NNK-d4（＞98%，加拿大Toronto Research Chemicals公司），用丙酮配制成标准储备液。甲苯（色谱纯，美国J.T.Baker公司）；无水硫酸镁（AR，天津市科密欧化学试剂有限公司，500℃马弗炉内烘5 h，冷却后置于干燥器内备用）；N-丙基乙二胺（PSA）、C18吸附剂（美国Supelco公司）。

Trace GC Ultra气相色谱，TSQ Quantum GC三重四极杆串联质谱仪（配AI/AS 3000自动进样器、美国Thermo Fisher公司）；SM450直线型吸烟机（英国Cerulean公司）；Talboys数显型多管式旋涡混合器（美国Talboys公司）；Sigma高速离心机（德国Sigma公司）；TruboVap LV型氮吹浓缩仪（瑞典Biotage公司）；GB204电子天平（感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

BaP和NNK单标储备液：准确称取10.0 mg标准品，用丙酮溶解并定容至10mL，得到质量浓度为1 000.0μg/m L的单标储备液，于-18℃冰箱中储存备用。

混合标准工作溶液储备液：分别取0.1mL BaP和NNK的单标储备液于100mL容量瓶中，用甲苯稀释定容，配制成质量浓度均为1.0μg/m L的混合标准工作溶液储备液，于4℃冰箱中储存。

内标工作溶液：以NNK-d4、和BaP-d12为内标，按目标物单标和混标工作溶液的配制方法，配制成质量浓度为4.0μg/m L的内标工作液，于4℃冰箱中储存。

1.2.2 样品处理与分析

卷烟平衡条件参照GB/T 16447—2004［16］；抽吸条件参照GB/T 16450—2004［17］，即每60 s抽吸1口，抽吸容量35mL，抽吸持续时间2 s。用直径44 mm剑桥滤片捕集卷烟主流烟气粒相物，每个滤片捕集5支卷烟。将捕集有卷烟主流烟气粒相物的剑桥滤片转移到50mL锥形瓶中，加入0.1mL内标工作溶液和20m L甲苯，在旋转振荡器上以200 r/m in振荡萃取30 m in后，取5mL萃取液于15mL离心管中，加入900 mg MgSO4，250 mg PSA和250 mg C18，以2 000 r/m in涡旋振荡2 min后，以5 000 r/min离心5 min，取上清液3mL，氮吹浓缩至1mL，过0.45μm有机相滤膜后进行GC-MS/ MS检测。GC-MS/MS分析条件为：

色谱柱：DB-35MS弹性石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度：250℃；柱不分流进样，时间1 min；载气：氦气（99.999%）；恒流模式，流速1.0mL/m in；进样量：1μL；总运行时间：42 min；EI电离模式，电离能70 eV；灯丝电流：50μA；离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氩气（99.999%），碰撞池压力：0.133 Pa；溶剂延迟：10 min；扫描方式：多反应监测（MRM）。BaP、NNK和两种内标的保留时间及质谱参数见表1。用Xcalibur2.1工作站软件进行数据处理。

表1 BaP、NNK及其内标的GC-MS/MS参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

图1 NNK和BaP在标准溶液(a)和实际样品萃取液(b)中的总离子流色谱图

本实验中需要优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先，分别对质量浓度为1μg/m L的NNK、BaP、NNK-d4和BaP-d12在m/z30～600之间进行全扫描（Full scan）分析，确定目标物的保留时间和一级质谱图，并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子。其次，对选定的母离子用子离子扫描的方式，确定二级质谱图，从中选择适宜的离子作为子离子。对每一组母离子/子离子，分别选择碰撞能量为5，10，15，20，25，30，35，40 eV进行扫描，以响应信号大小为依据对碰撞能量进行优化，得到最优的碰撞能量。目标物和内标的母离子、子离子及碰撞能量见表1。图1a为优化的质谱条件下，NNK和BaP的标准溶液在0.10μg/m L质量浓度下的总离子流色谱图（TIC），图1b为卷烟烟气萃取液中的总离子流色谱图。

2.2 净化方式的选择

NNK和BaP分别属于中等极性和非极性化合物，考虑到烟气萃取液的复杂性，实验的关键在于确定能够实现卷烟主流烟气粒相物中两种目标物同时净化的方法，且不会对目标物的回收率造成较大损失。目前标准方法中单独检测BaP和NNK时均采用固相萃取方法进行样品净化处理，因此，首先对固相萃取方法进行了考察。

2.2.1 固相萃取（SPE）

设计了两种方案：①极性溶剂萃取后过（非极性）反相柱，极性杂质流出而两种目标物被保留，然后用一种极性较弱的有机溶剂淋洗柱子，使目标物洗脱；②中等极性溶剂萃取后过（极性）正相柱，杂质被保留而目标物洗脱，上样即开始收集。

方案①：用甲醇萃取后，过苯基柱。CORESTA推荐方法中，测定BaP时萃取溶剂为甲醇［18］；而英美烟草（BAT）研发中心的方法中，测定TSNA时萃取溶剂也用甲醇［19］。因此，选择甲醇作为极性溶剂的代表。对于反相柱，主要考察了C18柱、苯基柱和环己基柱。考察方法和指标主要是利用20 ng/m L混合标准溶液上样，考察SPE处理过程中的上样穿透率、淋洗回收率和洗脱回收率。用甲醇萃取后，直接上样，结果发现BaP在3种小柱上的上样穿透率为20%～50%，而NNK的上样穿透率为40%～60%。这可能是因为甲醇对两种目标物的溶解性较强，导致其在固相萃取小柱上的保留效果较差。因此，在参照CORESTA方法的固相萃取步骤，并对上样溶液和洗脱溶剂的种类与体积进行考察后，确定了方案①的固相萃取步骤：分别用3mL水、3mL甲醇-水（40∶60，体积比）活化苯基柱；上样2.5mL（甲醇萃取液先与水混合形成甲醇-水=40∶60的混合液，然后再上样）；用3mL甲醇-水（40∶60，体积比）溶剂淋洗；最后用3mL二氯甲烷洗脱，收集二氯甲烷洗脱液。

方案②：用二氯甲烷-环己烷（1∶1，体积比）萃取后，过中性氧化铝柱。将两种标准方法中所采用的萃取溶剂混合［3-4］，作为中等极性溶剂的代表。考察指标同方案①。对于正相柱，主要考察弗罗里硅土柱、硅胶柱、ENVI-Carb小柱、中性氧化铝柱和碱性氧化铝柱。对20 ng/m L混合标准溶液考察发现，ENVI-Carb小柱对BaP的吸附作用较强，上样流出液和淋洗液中均未检出；而硅胶柱和弗罗里硅土小柱对NNK的吸附作用较强，上样流出液和淋洗液中均未检出；中性氧化铝柱和碱性氧化铝柱都可以实现对两种目标物的同时回收。但碱性氧化铝柱的再现性稍差，目标物浓度较高时（＞20 ng/m L），NNK和BaP的回收率较好；当目标物浓度较低时（＜10 ng/m L），约20%～30%的NNK保留在小柱上。最终确定了方案②的固相萃取步骤：3mL二氯甲烷-环己烷（1∶1，体积比）活化中性氧化铝小柱后，上样3mL萃取液，再用3mL二氯甲烷-环己烷（1∶1，体积比）淋洗，合并收集的上样流出液和淋洗液。

然而，在对实际样品进行考察时发现，两种固相萃取方案的净化效果均存在不足，因此引入了基质分散固相萃取（d-SPE）净化步骤。

2.2.2 基质分散固相萃取

确定的d-SPE基本步骤：取5mL萃取液于15mL离心管中，加入900 mg MgSO4，250 mg PSA和250 mg C18，2 000 r/m in涡旋振荡2 min后，以5 000 r/min离心5 min后，取上清液过有机相微孔滤膜后上样。当PSA用量较高时，对NNK有吸附作用，故选择在每毫升萃取液中加入50 mg PSA和50 mg C18进行共同净化。

2.2.3 3种净化方式的对比和选择

考察了萃取液、苯基柱净化液、中性氧化铝小柱净化液和d-SPE净化液中的共萃取基质的量［20］。取5mL未净化的萃取液置于已称重的洁净试管中，用氮气吹干后于110℃烘箱中干燥1 h，取出冷却后称量，与原试管质量之差即为萃取液中的共萃取基质的量，取两次测定的平均值为最终结果。采用3种不同净化方式得到的净化萃取液中共萃取基质的量见表2。

表2 不同净化方式处理后共萃取基质的量

由表2可知，采用苯基柱净化法得到的萃取液最好，但操作步骤较复杂，而且对色谱图上目标物附近的基质净化效果不明显；用中性氧化铝小柱净化后的萃取液其色谱图上干扰峰较多；基质分散固相萃取法的操作最简单，而且共萃取基质的量也与固相萃取法相当。因此，选择d-SPE净化方法。

2.3 萃取溶剂的选择

对于两种物质的同时萃取，既要保证两者的回收率，又要尽量减少共萃取基质的量。取空白滤片，加入0.1mL 1.0μg/m L混合标准溶液，放置过夜；分别加入20mL环己烷、正己烷、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮和乙腈，振荡萃取30 min；取1mL萃取液，用氮气吹干，加入1m L二氯甲烷-环己烷（1∶1，体积比）复溶，进行GC-MS/ MS分析。几种不同极性溶剂对两种物质的回收率结果见图2。由图2可知，8种溶剂对BaP的萃取效率均在100%左右；正己烷和环己烷对NNK的回收率较差，甲醇、甲苯、乙酸乙酯和二氯甲烷对两种物质的萃取效率均大于90%。

图2 8种不同萃取溶剂对NNK和BaP的萃取效率

取实际样品，分别用甲醇、甲苯、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，并按照1.2.2节方法进行前处理，测定目标物的回收率和共萃取基质的量。结果（表3）表明，以甲苯为萃取溶剂时，得到的共萃取基质的量最少，而且实际样品中两种目标物的回收率也较高。

表3 不同萃取溶剂对共萃取基质的量和两种目标物回收率的影响

考察了甲苯为萃取溶剂时的体积，分别用10，20，30，40mL甲苯萃取卷烟烟气粒相物中的NNK和BaP，对其萃取效率进行比较结果见表4。根据表4，最终确定用20mL甲苯振荡30 m in萃取主流烟气总粒相物中的两种目标物。

表4 不同体积甲苯对实际，样品中两种目标物的萃取效率 (ng·支-1)

2.4 工作曲线、定量限、回收率和精密度

分别取0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50和1.00mL 1.00μg/m L的混合工作储备液于10mL容量瓶中，加入0.1mL内标溶液，用甲苯定容至10mL，配制成目标物质量浓度分别为1，2，5，10，20，50和100 ng/m L，内标质量浓度为40 ng/m L的系列标准工作溶液。对上述系列标准工作溶液进行GC-MS/MS测定，内标法定量。以10倍信噪比确定定量限（LOQ）。

①空白滤片加标：回收率=测量值/加标量。空白滤片加标回收率实验：每个浓度4个平行，在空白滤片上分别添加目标物质量浓度2，5，10和20 ng/m L（相当于4，10，20和40 ng/支），按1.2.2节方法进行处理和分析，结果见表5。②捕集有粒相物的滤片上加标：回收率=［（加标样品滤片测量值-样品滤片测量值）/加标量］×100%。实际样品加标回收率实验：在含烤烟参比卷烟主流烟气粒相物的滤片上分别添加目标物浓度相当于4，10，20和40 ng/支，按1.2.2节方法进行处理和分析，结果见表6。

由表5和表6可知，除NNK在低浓度加标水平（4 ng/支）下的回收率稍差外，NNK和BaP在空白滤片加标和实际样品加标实验中的回收率均符合要求，为90%～110%，空白加标实验的RSD较小，实际样品加标实验的RSD偏大。NNK和BaP在实际样品中的LOQ分别为0.36和0.29 ng/支。

表5 标液中两种目标物的线性范围、LOQ以及空白滤片的加标回收率①

表6 实际样品中两种目标物的LOQ及加标回收率

表7 采用两种方法测定的27个卷烟样品主流烟气中NNK和BaP的释放量 (ng·支-1)

2.5 样品分析及与标准方法的对比

采用建立的方法和标准方法对27个卷烟样品进行检测，结果见表7。由表7可知，27个卷烟主流烟气粒相物中NNK和BaP的释放量分别为3.8～14.9和5.3～9.6 ng/支。以LC-MS/MS法NNK的检测结果对本方法的检测结果进行线性回归，以GC-MS方法BaP的检测结果对本方法的检测结果进行线性回归，NNK和BaP的线性相关系数分别为0.98和0.85。与标准方法相比较，大部分样品NNK的相对偏差小于20%，BaP的相对偏差小于10%。可见，本方法与现行标准方法的一致性较好。

3 结论

采用甲苯振荡萃取和基质分散固相萃取净化方式，建立了同时检测卷烟主流烟气中NNK和

BaP释放量的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）方法。NNK和BaP的定量限分别为0.36和0.29 ng/支，加标回收率为78.8%～106.6%，相对标准偏差均小于15.4%。本方法操作简单、结果准确，适合于卷烟主流烟气中NNK和BaP的同时检测。

［1］Hecht S S.Tobacco smoke carcinogens and lung cancer［J］.Journal of the National Cancer Institute,1999，91（14）：1194-1210.

［2］谢剑平，刘惠民，朱茂祥，等.卷烟烟气危害性指数研究［J］.烟草科技，2009（2）：5-15.

［3］GB/T 21130—2007卷烟烟气总粒相物中苯并［a］芘的测定［S］.

［4］GB/T 23228—2008卷烟主流烟气总粒相物中烟草特有N-亚硝胺的测定气相色谱-热能分析联用法［S］.

［5］朱文静，杨俊，刘百战，等.UPLC-MS/MS对卷烟烟气中4种烟草特有亚硝胺的快速测定［J］.分析测试学报，2010，29（1）：26-30.

［6］XIONG Wei，HOU Hongwei，JIANG Xingyi，etal. Simultaneous determ ination of four tobacco-specificN-nitrosam ines in mainstream smoke for Chinese Virginia cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and validation under ISO and“Canadian intense”machine smoking regimes［J］.Analytica Chimica Acta，2010，674（1）：71-78.

［7］刘立全.用HPLC/MS/MS仪定量分析烟丝和烟气中的TSNA［J］.烟草科技，2002（1）：31-33.

［8］吴名剑，胡念念，李勇，等.卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺的液质联用分析［J］.烟草科技，2007（10）：41-45.

［9］毛友安，钟科军，卢红安，等.气相色谱-质谱联用法测定卷烟主流烟气中的烟草特有亚硝胺［J］.理化检验：化学分册，2008，44（6）：529-531.

［10］顾文博，周宛虹，陆怡峰,等.气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺［J］.烟草科技，2013（10）：40-43，48.

［11］王春兰，汪军霞，胡静，等.加速溶剂/固液固萃取-气相色谱/质谱法分析卷烟烟气中的苯并［a］芘［J］.分析化学，2013，41（7）：1069-1073.

［12］程倩，张洪非，侯宏卫，等.高效液相色谱法测定卷烟主流烟气中的苯并［a］芘［J］.烟草科技，2012（2）：29-32.

［13］张峻松，戴勇，贾春晓，等.卷烟主流烟气中苯并［a］芘的HPLC测定［J］.烟草科技，2003（4）：22-24.

［14］边照阳，唐纲岭，陈再根，等.全自动固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定卷烟主流烟气中的3种多环芳烃［J］.色谱，2011，29（10）：1031-1035.

［15］尉朝，孙海峰，陈嘉彬，等.气相色谱-串联四极杆质谱法测定主流烟气中的苯并［a］芘［J］.质谱学报，2013，34（2）：110-114.

［16］GB/T 16447—2004烟草及烟草制品调节和测试的大气环境［S］.

［17］GB/T 16450—2004常规分析用吸烟机定义和标准调节［S］.

［18］CORESTA recommended method No58—Determination of benzo［a］pyrene in mainstream cigarette smoke by GC-MS［S］.

［19］British American Tobacco Group.Research&development method—Determination of tobacco-specific nitrosam ines in mainstream smoke［EB/OL］.［2014-11-14］.http://www.bat-science.com/.

［20］Lehotay S J，Son K，K won H，etal，Comparison of QuE ChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（16）：2548-2560.

责任编辑 洪广峰

Simultaneous Determ ination of Benzo[a]pyrene and NNK in Mainstream Cigarette Smoke by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xiaoshui,TANG Xiaodong,ZHANG Bo,JIANG Jialei,ZHU Shuxiu,and LU Minghua*
Technology Center of China Tobacco Zhejiang Industrial Co.,Ltd.,Hangzhou 310024,China

A method for simultaneously determining the benzo[a]pyrene(BaP)and 4-(N-methyl-N-nitrosam ino)-1-(3-pyridy l)-1-butanone(NNK)in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)was developed.The total particulatematter of mainstream cigarette smoke was collected on a Cambridge filter pad,then extracted with toluene by oscillation.The extract was cleaned up by dispersive solid phase extraction(d-SPE),concentrated by nitrogen gas flow,separated by DB-35MS column,and determ ined by internal standard method under multi-reaction monitoring(MRM) mode.The results showed that：1)The limits of quantitations(LO Qs),recoveries and relative standard deviations(RS Ds)of NNK and BaP were 0.36 and 0.29 ng/cig,78.8%-95.5%and 101.6%-106.6%, 2.3%-15.4%and 2.9%-14.4%,respectively.2)Com paring with the standard method,the developed method was simpler in pretreatment,and capable of simultaneous determ ination of the two target analytes.3)The data of 27 cigarette samples determ ined by the developed method well agreed with those by the standard method,there was no significant difference.The method is simple,accurate and suitable for the simu ltaneous determ ination of NNK and BaP in mainstream cigarette smoke.

TS411.2

A

1002-0861（2015）09-0050-06

10.16135/j.issn1002-0861.20150909

2014-11-12

2015-04-30

陈晓水（1987—），硕士，助理工程师，主要从事烟叶与卷烟农残分析、烟气化学成分分析工作。E-mail：chenxiaoshui@zjtobacco.com；*

陆明华，E-mail：lumh@zjtobacco.com

陈晓水，汤晓东，张博，等.气相色谱-串联质谱法同时检测卷烟主流烟气中的苯并［a］芘和NNK［J］.烟草科技，2015，48（9）：50-55.

CHEN Xiaoshui,TANG Xiaodong,ZHANG Bo,etal.Simultaneous determ ination of benzo[a]pyrene and NNK in mainstream cigarette smoke by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Tobacco Science&Technology, 2015，48（9）：50-55.