SD大鼠肝脏枯否细胞分离方法改进研究

李 亮 彭 琼 戴 夫

SD大鼠肝脏枯否细胞分离方法改进研究

李 亮 彭 琼 戴 夫

目的 研究一种简单、高效、实用并且稳定的SD大鼠肝脏原代枯否细胞(KCs)的提取及培养方法。方法选择体质量200 g左右的健康SD雄性大鼠，采用0.05% IV型胶原酶在体原位灌注法结合剪碎法，37℃水浴振荡20 min，经30%和60% Percoll密度梯度离心后，再经40% Percoll离心及贴壁法纯化提取KCs。倒置显微镜下观察细胞形态，并用台盼蓝染色实验鉴定细胞活力，吞墨实验观察细胞吞噬功能及流式细胞术鉴定细胞纯度。结果每只大鼠平均肝脏KCs的获得量为(1.00±0.20)×107(n=20)，细胞活力为(92.34±0.15)%，细胞纯度均在(93.56±0.24)%。结论改良的SD大鼠肝脏KCs提取方法操作简单，效果可靠，可为今后KCs的研究奠定基础。

枯否细胞；细胞分离；原代培养；细胞鉴定

枯否细胞(Kupffer cells,KCs)位于肝脏的肝血窦内，固定于窦壁，是机体单核巨噬细胞系统主要组成部分,占全身单核巨噬细胞总量的80%～90%[1]，也是肝脏炎症反应中主要的效应细胞，发挥着重要的免疫调节功能[2]。研究KCs的功能，对阐明KCs相关疾病的发病机制具有重要作用，但KCs的分离培养比较困难，在一定程度上阻碍了对KCs相关疾病的研究[3]。KCs分离、培养方法的不断改进，可以为研究各种肝病奠定基础，具有重要理论和现实意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物 20只健康雄性SD大鼠，清洁级，体质量200 g左右，购于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，动物许可证号SCXK(苏)2014-0007。室温下自由进食标准颗粒饲料、卫生饮水。实验前12 h禁食，6 h前禁水。

1.2 主要试剂和仪器 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；Percoll细胞分离液为Pharmacia公司产品；台盼蓝为Sigma公司产品；APC-CD68抗体为eBioscience公司产品；TSl00倒置显微镜为日本Nikon公司产品；IX51 荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品；AllegraX-30R梯度离心机为Beckman Coulter公司的产品。1.3 细胞分离液配制 胶原酶灌注液：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L、Na2HPO4·12H2O 0.7 mmol/L，Hepes 10 mmol/L，Glucose 15 mmol/L，CaCl225 mmol/L、Ⅳ型胶原酶 0.1%，青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL。Percoll分离液：100% Percoll分离液，9 份Percoll原液+1 份8.5% NaCl；30% Percoll分离液，3份100% Percoll分离液+7份0.85% NaCl；60% Percoll分离液,6份100% Percoll分离液+4份0.85% NaCl。1.4 实验操作 SD大鼠乙醚麻醉后，腹腔注射肝素1 500 U/100 g，依次消毒，开腹，暴露出门静脉并插管固定，打开胸腔同时结扎下腔静脉。缓慢灌注PBS 50 mL，速度约为10 mL/min，扎破下腔静脉放血，反复操作3次左右，观察肝脏颜色已变成灰黄色停止灌注PBS。37℃预热胶原酶灌注液15 mL，缓慢灌注，约15 min后剪下肝脏并迅速剪碎，放置于37℃振荡培养箱中消化20 min。200目过滤网过滤后，将收集的肝悬液加PBS至45 mL，300 g×5 min(4℃)离心2次，去上清。所得沉淀用PBS加至45 mL，充分重悬后，50 g×3 min(4℃)离心;吸取上清转移至另一个50 mL离心管中，550 g×5 min(4℃)离心，去上清。将上述肝细胞悬液缓慢移入含30%和60% Percoll分离液的离心管中，以800 g(20℃)缓升缓降离心20 min，离心后可见乳白色细胞层,见图1。收集该细胞层细胞悬液后用40% Percoll分离液再次600 g×5 min(4℃)离心，去上清，用20%胎牛血清的低糖DMEM培养基充分吹打重悬细胞。所得细胞1×106/mL密度接种至六孔板中，置于5% CO2培养箱(37℃)中培养，5～6 h后用PBS洗去未贴壁的非实质细胞，继续培养。

1.5 细胞鉴定 活力鉴定：细胞提取后，立即以10 μL细胞悬液和90 μL 0.4%台盼蓝充分混匀，2～3 min后，取10 μL至计数板，显微镜下观察计数。细胞鉴定：用培养24 h后的细胞，加入经过滤纸多次过滤并高压灭菌过得墨汁，6 h后显微镜下观察细胞的吞噬能力。流式细胞术鉴定细胞纯度：将提取并洗涤纯化后的细胞经CD68流式抗体染色，经流式细胞仪检测，分析细胞的纯度。

2 结果

2.1 KCs数量及活力 细胞获得量为(1.00±0.2)×107，经多次实验(n=3)，台盼蓝染色鉴定细胞活力为(92.34±0.15)%,见图2。

2.2 细胞形态 刚获得的细胞，形态大小基本一致，金黄色，近圆形，折光性强，悬浮于培养基中；继续培养5～6 h，细胞贴壁良好，呈扁圆形，偶见梭形及多角形，金黄色；培养24 h后KCs开始伸展，胞体增大，且形状趋于不规则并有伪足伸出。培养7 d时，可见更多梭形细胞及形状不规则细胞。见图3～图5。

2.3 吞噬功能试验 KCs可吞噬>2 μm的颗粒，墨汁颗粒直径约0.3 μm，本实验6 h后见较多细胞吞噬了墨汁颗粒，故提示提取的目的细胞有较强的吞噬能力。在培养24 h后的细胞中加入少量碳素墨水继续培养6 h，可见镜下细胞99%以上均吞噬黑色碳颗粒,见图6、图7。

2.4 流式细胞术鉴定细胞纯度 将提取并洗涤纯化后的细胞经CD68流式抗体染色，经流式细胞仪检测，分析细胞的纯度,见图8、图9。经过多次实验(n=3)，提取的细胞纯度均在(93.56±0.24)%。

3 讨论

肝脏KCs作为体内最大的巨噬细胞群，在全身炎症反应的发生、发展中起十分重要的作用[4]。目前对肝脏KCs的研究越来越多，摸索出一套高效、稳定并且易于操作的分离、培养方法尤为重要。目前国内外分离、培养KCs的方法比较多，有选择性贴壁法[5]，免疫磁珠法，流式细胞术分离法[6]，密度梯度离心法等。磁珠分离法价格昂贵，有些实验不易操作，比如分离肝脏并保留门静脉及下腔静脉，离体后再插管或将已经固定插管的门静脉剥离，在实际的操作过程中，容易使插管滑落或插破血管从而导致实验失败，选择性贴壁法则很难提取到高纯度的KCs。诸如此类的研究报道有很多，各有差异，且存在不足之处。本研究吸收了相关研究中的精华之处，是综合而成的一种高效、稳定，尤其是易于操作的KCs的提取、培养方法。

首先，已有实验证明采用在体原位灌注法的效果及可行性较离体后再灌注要好[7]。本实验曾尝试离体后再灌注[8]，但分离肝脏后，血管塌陷，血凝块阻塞等问题造成插管失败或灌注不均匀，即使原位插管分离后灌注，也会因肝脏包膜破损而导致灌注失败。本实验采用在体原位灌注，解决了以上问题，且用含有双抗的PBS液洗涤，可明显降低污染几率。其次，肝脏消化是整个操作环节中重要步骤，结合剪碎法，能有效缩短操作时间，提高实验效果。有学者再次将获得的肝悬液加入少许IV型胶原酶，能更好的起到消化作用[9]，IV型胶原酶原位灌注10～15 min对于肝脏非实质细胞的提取是有益的[10]。如果肝脏消化时间过长，容易对细胞活力及表面标记物产生影响；直接剪碎法时间较长，易造成消化不完全，影响KCs提取率，经原位灌注消化后结合剪碎法可以提高KCs的提取率。因此，本实验IV型胶原酶灌注时间加剪碎法严格控制在20 min以内。再次，由于在Percoll分离后，吸出目的细胞的过程中，不管是采用何种方法都难免会混入少量杂细胞，所以本实验增加了40%Percoll再次离心的实验步骤，除去上清后重悬培养即可获得高纯度的KCs。最后，鉴于KCs较其他肝脏细胞有较强的贴壁能力，培养5～10 min后即开始贴壁，4 h后大部分KCs已牢固贴壁[11]，因此培养5～6 h后用PBS洗去未贴壁的细胞继续纯化，可以得到高纯度的KCs。本实验综合了各种操作法的优势，进一步提高了KCs的提取纯度和活力。

经过反复实践摸索，本实验有以下关键几点：①胶原酶灌注液需在37℃温箱中提前预热，才能发挥酶最大效应；②IV型胶原酶在体灌注时间要严格控制在10～15 min，消化时间过长过短均不利于KCs的提取；③在配置不同密度Percoll分离液和加入细胞悬液时，在滴加的过程中保持液体贴着管壁缓慢加入，避免两层液体剧烈波动破坏密度梯度；④实验过程中密度梯度离心需要控制升降速度，升降速度过快过慢均易造成密度梯度破坏，本实验采用升6降2的离心数值，效果满意。此外，本实验主要改进点有以下几点：①采用0.05% IV型胶原酶在体灌注消化与减碎法相结合，充分利用两种方法的优势而回避了两种方法的弊端，既保证了实验的效果又提高了实验的可操作性；②在30%、60% Percoll密度梯度离心之后加入40% Percoll工作液进一步纯化的实验步骤，能有效的分离出混入的杂细胞，对细胞的进一步纯化有非常好的效果；③在前人的基础上，精简了实验操作步骤，尽量缩短实验的操作时间，可以大大提高细胞的提取量及活力。

综上所述，本研究摸索了一套改良KCs分离和鉴定的方法，综合胶原酶在体灌注和离体消化、密度梯度离心和选择性贴壁法，机械分离和振荡孵育各种方法优点，最大程度的消化肝组织，保证KCs纯度及活力能进一步用于其他实验，操作步骤简便易行，能更好的为其他实验奠定基础。

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[8] 李敏利,许小兵,杨妙芳,等.SD大鼠肝枯否细胞分离培养的改良方法与鉴定[J]. 医学研究生学报,2012,25(7):702-706.

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(2014-10-21 收稿 2015-01-04 修回)

Improvement of isolation and cultivation of liver Kupffer cells of SD rats

LiLiang,PengQiong,DaiFu

DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity(theFirstPeople′sHospitalofHefeiCity),HeFei230022,China

Objective To explore the effects of Kupffer cells (KCs) on various liver diseases by building a simple, efficient, practical and stable method for extraction and primary culture of KCs in SD rats. Methods The liver of healthy male SD rats which weighted about 200 g was perfused in situ by 0.05% type IV collagenase and cut into small pieces; the fragments were vibrated 20 mins in water bath(37℃); 30% and 60% Percoll were used for density gradient centrifugation followed by 40% Percoll centrifugation to extract KCs; the purification of KCs was performed with plastic adherent at last. Cell morphology was observed under inverted microscope, and viability was detected by Trypan blue staining experiment; swallowing ink experiment was performed to observe phagocytosis, and flow cytometry was used for identification of purity. Results (1.00±0.20)×107(n=20) KCs were obtained per rat, the cells viability was (92.34± 0.15)%, and the purity was (93.56± 0.24)%. Conclusion The improved method has the advantages of simple operation and reliable effect, which lay the foundation for future research and thus is worth promotion.

Kupffer cells; Cell separation; Primary culture; Cell identification

230011 安徽医科大学第三附属医院(合肥市第一人民医院)消化内科

戴夫，hfsdf@sina.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.004