高效液相色谱法测定愈伤灵胶囊中黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1含量＊

张正锋，张 毅

(重庆市食品药品检验所·重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121)

中药材及其制剂在加工、运输、储存过程中经常会发生霉变现象，产生霉菌毒素，其中以黄曲霉毒素的毒性最大。黄曲霉毒素已被世界卫生组织的癌症研究中心确定为一类致癌物，其毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。当前世界各国已在很多食品、药品标准中都制订了严格的黄曲霉毒素残留限度，2010年版《中国药典(一部)》已开始对中药材中黄曲霉毒素进行控制，并收载了黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1的检测方法。愈伤灵胶囊为传统中成药，处方包括土鳖虫、续断、三七、当归、自然铜等药味，其中土鳖虫可能污染黄曲霉毒素[1]，且土鳖虫、当归、三七都是原生药粉入药，因此有必要制订黄曲霉毒素检查项，以控制产品质量，保证用药安全。《中国药典(一部)》只对桃仁、胖大海、陈皮、僵蚕等中药材规定了限度，香港卫生署公布的中药材标准中对当归、三七制订了黄曲霉毒素的限量检查[2]。近年来越来越多的研究已经发现，中成药中也有黄曲霉毒素残留[3－5]。本研究中按照2010年版《中国药典(第二增补本)》附录中黄曲霉毒素残留量测定法[6]，采用免疫亲和柱净化－高效液相色谱(HPLC)－柱后光化学衍生－荧光检测技术，测定愈伤灵胶囊中黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1的残留量，并对阳性样品采用超高效液相色谱－串联质谱(UPLC－MS/MS)法进行了验证。

1 仪器与试药

Waters2695型高效液相色谱仪(Waters2475荧光检测器＜美国Waters公司＞，光化学衍生器＜美国VICAM公司，紫外光灯254 nm＞，Waters ACQUITY TM串连四级杆质谱仪＜MassLynx工作站＞);免疫亲和层析柱(北京华安麦科生物技术有限公司);MSU224S－100－DU型电子天平(德国Sartorius公司);超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);Z2064型离心机(德国HERMLE公司);Milli－Q超纯水处理系统。愈伤灵胶囊为售样品;甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水;黄曲霉毒素混合标准品(黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2质量浓度分别为 1.04，0.35，1.18，0.59 μg/mL，中国食品药品检定研究院，批号为610001－201301)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 HPLC

色谱柱:DikmaDiamonsilC18柱(250mm ×4.6 mm，5 μm);柱温:40℃;流动相:甲醇(A)－乙腈(B)－水(C)，梯度洗脱(0～17 min，A 25% →45% ，B 10% ，C 65% →45%;17～18 min，A 45% →65%，B 10%，C 45%→25%;18 ～23 min，A 65%，B 10%，C 25%;23～24 min，A 65% →25% ，B 10% ，C 25% →65%);流速:1.1 mL/min;进样量:30 μL。采用柱后光化学衍生法:光化学衍生器(254 nm);以荧光检测器检测，激发波长λex=360 nm，发射波长λem=450 nm。色谱见图1。

2.1.2 UPLC － MS/MS

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1mm，1.7 μm);柱温:30 ℃;流速:0.4 mL/min;进样量:5 μL;流动相:A为甲醇－乙腈(3∶2)，B为0.1%乙酸水溶液，梯度洗脱(0～5 min，A 40% →70% ，B 60% →30%;5～6 min，A 70% ，B 30%;6 ～6.5 min，A 70% →40% ，B 30% →60%);ESI正离子 MRM 模式:离子源温度120℃，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流速500 L/h;鞘气流速50 L/h;定性离子对及相关参数见表1。

2.2 溶液制备

图1 高效液相色谱图

表1 UPLC－MS/MS法定性离子对、锥孔电压及碰撞能量

精密量取黄曲霉毒素混合标准品0.5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备液(黄曲霉毒素B1质量浓度为50 ng/mL)。精密量取贮备液1 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1质量浓度为2 ng/mL)。取供试品粉末5 g，精密称定，加氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液50 mL，振摇使溶散，超声处理30 min，离心5 min(离心速度4 000 r/min)，精密量取上清液10 mL，置50 mL容量瓶中，加水约 25 mL，振摇，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm微孔滤膜滤过;精密量取20 mL，通过免疫亲合层析柱，流速为3 mL/min，再用水10 mL洗涤，洗液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，以1.5 mL甲醇以重力作用自然洗脱，收集洗脱液至2 mL量瓶中，并用甲醇稀释刻度，摇匀，即得供试品溶液。取70%甲醇溶液50 mL，按供试品溶液制备方法下操作，即得空白溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:取黄曲霉毒素混合对照品溶液，分别进样3，5，10，15，20，25，30 μL，以各色谱峰峰面积(Y)对黄曲霉毒素绝对量(X)进行回归，得回归方程。结果见表2。

表2 黄曲霉毒素线性范围

精密度试验:将混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1质量浓度为2 ng/mL)连续进样 6 次，依法测定。结果黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1的 RSD 分别为 1.29% ，1.45% ，1.88% ，1.51%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取不含黄曲霉毒素的样品粉末5 g，精密称定，精密加入黄曲霉毒素混合对照品贮备液0.1 mL，依法制备供试品溶液，分别于 0，4，8，12 h进样，依法测定。结果黄曲霉毒素 G2，G1，B2，B1含量的 RSD 分别为 1.43% ，1.09% ，1.58% ，1.09%(n=4)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验:取不含黄曲霉毒素的样品粉末5 g，共6份，精密称定，精密加入黄曲霉毒素混合对照品贮备液0.1 mL，依法制备供试品溶液并测定。结果黄曲霉素G2，G1，B2，B1的 RSD分别为8.0% ，10.9% ，8.9%，6.2%(n=6)，表明该法重复性良好[2]。

加样回收试验:对该方法进行三水平加样回收试验。添加浓度以黄曲霉毒素B1计分别为1，5，10 μg/kg。取不含黄曲霉毒素的样品粉末5 g，精密称定，共取9份，分别精密加入混合对照品贮备液 0.1，0.5，1.0 mL，依法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。结果见表3。参照相关技术要求，回收率范围应为50% ～120%，RSD＜15%[2]，表明该法的加样回收试验结果符合要求。

表3 黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1加样回收试验结果(%，n=9)

检出限与定量限确定:将上述加样回收试验的供试品溶液稀释成适当浓度进样分析，检出限为信噪比(S/N)=3，定量限为S/N=10，则以黄曲霉毒素B1计，仪器检出限为0.25 pg，定量限为 0.83 pg，本法的定量限为 0.14 μg/kg。黄曲霉毒素 B2，G1，G2按此方法得到的定量限分别为 0.06，0.21，0.13 μg/kg。

2.4 样品含量测定

结合线性、加样回收率及仪器检出限与定量限测定，本试验报告限暂订为:黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2及其总量(B1+B2+G1+G2)均为0.5 μg/kg，低于报告限的视为未检出。测定了82批愈伤灵胶囊样品，结果49批样品检出黄曲霉毒素，黄曲霉毒素总量≥10 μg/kg的有 9 批，其中 6 批黄曲霉毒素 B1≥5 μg/kg，见图 2(仅列出阳性样品黄曲霉毒素B1及总量)。

2.5 阳性样品确证试验

图2 阳性样品含量测定结果

黄曲霉毒素B1，G1在含水的溶剂中发生荧光淬灭，经波长254 nm的紫外光灯照射后，形成具有稳定荧光的物质，即是柱后光化学衍生的原理。故采用衍生与未衍生时黄曲霉毒素的峰面积比较，即可简单地对阳性样品进行初步确认。本试验结果显示，衍生后黄曲霉毒素B1的峰面积约为未衍生时的9倍，G1的峰面积约为未衍生时的12倍，与郝爱鱼等[7]报道基本一致。以每1成分选取2对灵敏度最高的子母离子，采用MRM模式检测，样品在与对照品相同保留时间处同时检出2对离子对，且其强度的比值与对照品一致，即可确证样品中含有黄曲霉毒素。MRM图见图3。

图3 MRM离子流图

3 讨论

对供试品取样量、提取方式、稀释倍数等进行了考察与优化，每一个因素考察均以加样回收率进行评判，最终确定文中的试验方法。药典HPLC方法采用了等度洗脱，洗脱时间长且分离度、峰形均欠佳。本研究改为梯度洗脱，4个成分的保留时间在12.0～17.5 min，峰形明显改善且分离度均大于1.5。

对UPLC－MS/MS的流动相、梯度洗脱程序、碰撞能量等进行了适当优化，并对数批阳性样品进行了验证，由于阳性样品大多只检出黄曲霉毒素B1，G1，仅少量检出B2和G2且量极低，故本试验最终只对B1，G1进行了确证。

样品经专属性极强的免疫亲和柱净化后，在黄曲霉毒素色谱峰附近无干扰峰。鉴于中药成分复杂，为了排除假阳性干扰，对阳性样品采取了衍生/不衍生峰面积比及UPLC－MS/MS进行确证。

由于黄曲霉毒素毒性极强而我国目前尚缺乏其毒理学等相关的实验室数据，因此建议参照2010年版《中国药典(一部)》陈皮等药材品种项下规定的黄曲霉毒素残留量限度，暂订愈伤灵胶囊中黄曲霉毒素限量为“本品每1 000 g含黄曲霉毒素B1不得过5 μg，含黄曲霉毒素 G2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素B1的总量不得过10 μg”。本次试验82批样品黄曲霉毒素的检出率为59.76%，不合格率为10.98%。

从愈伤灵胶囊中黄曲霉毒素的检测情况看来，对于含有容易污染黄曲霉毒素的中药材的中成药，尤其是含生药原粉的制剂，应重点进行黄曲霉毒素监控。

[1]杨晓丽，仇 峰，韦日伟，等.高效液相色谱－串联质谱法同时测定地龙中4个黄曲霉毒素[J].药物分析杂志，2012，32(4):627－630.

[2]中华人民共和国香港特别行政区卫生署中医药事务部.霉菌毒素(黄曲霉毒素)测定方法[EB/OL].[2005 －09 －01].http://www.cmd.gov.hk/hkcmms/vol1/Docs/Appendix_Ⅶ _Determination_of_Mycotoxins(Aflatoxins)_chi.pdf.

[3]刘 宁，王萌萌，金红宇，等.高效液相色谱－柱后光化学衍生法测定参苓白术散中黄曲霉毒素 G2、G1、B2、B1[J].中国药事，2012，26(5):442－445.

[4]郑 荣，毛 丹，王少敏，等.脑立清丸等6种中成药中黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1的测定[J].中成药，2010，32(3):418 －422.

[5]刘亚荣，逯雯洁，刘海清，等.免疫亲和柱净化－柱后光化学衍生－高效液相色谱荧光法测定饱和系列制剂中黄曲霉毒素[J].中成药，2012，34(3):678 － 681.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典(第二增补本)[M].北京:中国医药科技出版社，2013:187.

[7]郝爱鱼，赵丽元，刘英慧，等.HPLC法测定中药饮片中黄曲霉毒素残留量的假阳性研究 [J].药物分析杂志，2013，33(3):458－464.