补肾抗风湿方药对CIA大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG系统的影响

庞学丰　蒙宇华　冯玉青　吴燕红　唐丽萍　刘欢　龙朝阳　廖键侥　舒建龙　李玉玲　雷宗尚　林菊

【摘 要】目的：观察补肾抗风湿方药寒痹康汤对CIA大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG系统的影响，揭示其抗类风湿关节炎骨质侵蚀的作用机制。方法：采用弗氏不完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA大鼠模型，将60只Wistar大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，甲氨蝶呤组，寒痹康汤高、中、低剂量组，以甲氨蝶呤组为对照，观察不同剂量寒痹康汤对CIA大鼠骨组织RANKL、RANK和OPG表达水平的影响。结果：与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织的RANKL mRNA、RANK mRNA、RANKL蛋白、RANK蛋白的表达升高，OPG mRNA、OPG蛋白的表达下降（P < 0.01）；与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和甲氨蝶呤组的RANKL mRNA、RANK mRNA、RANKL蛋白、RANK蛋白的表达均有不同程度的下降，OPG mRNA、OPG蛋白的表达均有不同程度的升高（P < 0.01或P < 0.05），其中以寒痹康汤高剂量组最明显；寒痹康汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：寒痹康汤能抑制CIA大鼠的关节炎严重度，提高骨组织中OPG蛋白和基因表达，抑制RANKL和RANK的蛋白和基因表达，提示其具有抗类风湿关节炎骨质侵蚀的作用，机制可能与调控OPG/RANKL/RANK破骨细胞分化调节信号传导系统有关。

【关键词】 关节炎，类风湿；补肾抗风湿方药；寒痹康汤；RANKL/RANK/OPG系统；CIA大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.002

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of invigorating kidney and anti rheumatism prescription Hanbi Kang Tang（寒痹康汤） on the RANKL/RANK/OPG bone tissue system of CIA rats to reveal its mechanism of anti- Rheumatoid Arthritis bone erosion.Methods：Bovine type II collagen emulsified with Freunds incomplete adjuvant was used to induce CIA rat models.Sixty Wistar rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，a methotrexate group，and Hanbi Kang high，medium and low dose groups.The methotrexate group was used as an object of reference to observe the influence of difference doses of Hanbi Kang Tang on the expression of rat bone tissue RANKL，RANK and OPG.Results：Compared with the normal control group，the expressions of RANKL mRNA，RANK mRNA，RANKL，and RANK proteins in rats of the model control group increased，while the expressions of OPG mRNA and OPG proteins decreased（P < 0.01）.Compared with the model group，the expressions of RANKL mRNA，RANK mRNA，RANKL，and RANK proteins in rats of the Hanbi Kang groups and the methotrexate group decreased in different degree，while the expression of OPG mRNA and OPG proteins decreased

（P < 0.01 or P < 0.05），among which the Hanbi Kang high dose group was the most obvious，with no significant difference compared with the methotrexate group（P > 0.05）.Hanbi Kang could inhibit the progression of arthritis in CIA rats，improving the expressions of OPG protein and gene in bone tissue，and inhibiting the expressions of RANKL and RANK proteins and gene.Conclusion：Hanbi Kang Tang has the effect of anti-RA bone erosion，whose mechanism may be related to the regulation of OPG/RANKL/RANK osteoclast differentiation regulating signal transduction system.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；prescription of invigorating kidney and anti rheumatism；Hanbi Kang Tang（寒痹康汤）；RANKL/RANK/OPG system；CIA rat

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种机体对自身滑膜发生免疫反应为主要表现的疾病，而骨质疏松（osteoporosis，OP）是RA常见的临床合并症。OPG/RANKL/RANK是一组新近发现的破骨细胞分化调节信号因子，在RA的骨质侵蚀中扮演重要角色，可能成为RA治疗的新靶点。本实验采用牛Ⅱ型胶原蛋白和弗氏不完全佐剂混合诱导CIA大鼠模型，观察寒痹康汤对CIA大鼠骨组织RANKL/RANK/OPG系统的影响，探讨其治疗RA骨质侵蚀的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 60只健康级Wistar大鼠，雌性，体质量（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。

1.2 实验试剂及药品 弗氏不完全佐剂和牛Ⅱ型胶原蛋白（美国Chondrex公司）；甲氨蝶呤[MTX，上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂]；补肾抗风湿方药（寒痹康汤）提取物（广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备），将寒痹康汤（秦艽15 g、黄芪15 g、青风藤15 g、防风10 g、熟附子10 g、麻黄10 g、当归10 g、淫羊藿20 g、狗脊20 g）经乙醇萃取，50 ℃溶解离心，取上清液得到含有活性部位的浸膏，实验前用溶剂（2%乙醇+ 98%的生理盐水）配制成2×10-7 g·L-1的溶液。

2 方 法

2.1 造模方法 适应性饲养7 d后，随机取10只为正常对照组，其余大鼠参照文献[1]方法进行造模：在无菌条件下，用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，浓度为4 mg·L-1，置4 ℃冰箱过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂

（1 mg·mL-1）混合、震荡充分乳化，制成C II乳剂，置4 ℃冰箱保存备用。实验时于每只大鼠颈、背部多点皮内注射0.25 mL致炎，于14 d后按上述方法和剂量再次注射免疫。造模成功（大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm，评分在4分以上）后随机分为5组：模型对照组，MTX组，寒痹康汤高、中、低剂量组，每组10只。全部大鼠造模均成功，实验过程中无死亡。

2.2 给药方法 造模成功再次分组后，开始给药（剂量参照文献[1]）：正常对照组大鼠自由进食和饮水；模型对照组予生理盐水2 mL·（100 g）-1

灌胃，每日1次；MTX组灌服MTX药液2.7 mg·kg-1

（为70 kg成人临床用药3倍），每只约0.405 mg，

每周1次；寒痹康汤高、中、低剂量组，分别以31.25，15，7.5 g·（100 g）-1灌胃，每日2次。

2.3 取材方法 正常对照组及各实验组大鼠治疗36 d后处死，以无菌器械迅速取下右侧胫、股骨，剥离肌肉和软组织，骨组织称重后装入DEPC处理过的1.5 mL离心管，投入液氮。全部动物取材完毕后转入-80 ℃冻存。

2.4 Western blot检测 骨组织中提取总蛋白，每个标本取80 μg蛋白质，BCA法检测蛋白含量，每个孔上样量为30 μg，加上样缓冲液，PCR仪99.9 ℃变性5 min，4 ℃备用。制备质量分数为12%的分离胶和质量分数为5%浓缩胶，上样电泳，进行SDS-PAGE分离。电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜上，100 mA转膜1 h，用质量分数为5%的脱脂奶粉封闭1 h，TBST、TBS 洗膜后一抗RANKL（1∶200稀释）、RANK（1∶200稀释）、OPG（1∶1000 稀释）、Actin（1∶200稀释）

4 ℃过夜。次日，TBST、TBS洗膜后二抗室温孵育1 h，经过ECL化学发光，采集图像光密度，获得图像用Image Tool 3.0测定并分析条带吸光度（IA），以Actin为内参。

2.5 实时定量PCR检测 用Trizol试剂（美国Gibco公司）提取骨骼肌组织总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR扩增。每个样本设3个复孔。引物由上海基尔顿生物技术有限公司合成。引物序列：OPG正义链5'-TCCTGGCACCTACCTAATACAGCA-3'，

反义链5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'；

RANK正义链5'-ACGTGGACCCTTGCCCCAGT-3'，

反义链5'-ACTGGCCACCAGGGGAGCTT-3'；RANKL

正义链5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'，反义

链5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'。管家基因Actin作为内参，正义链5'-CGGGAAATCGTGCG

TGACAT-3'，反义链5'-GAACTTTGGGGGATGCTCG

-3'。PCR反应体系：5×PCR缓冲液10 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，GAPDH上、下游引物各0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq酶1 μL，双蒸水32 μL，

cDNA 模板5 μL。PCR反应条件：50 ℃2 min，

95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃45 s，40个循环，最后72 ℃延伸10 min。按照ΔΔCt解析法进行目的基因与管家基因的相对定量。

2.6 统计学方法 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用方差分析及χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 寒痹康汤对CIA大鼠骨组织RANKL表达水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织的RANKL mRNA的表达升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组的RANKL mRNA的表达均不同程度的下降

（P < 0.01或P < 0.05），其中寒痹康高剂量组下降最明显；但与MTX组比较，差异无统计学意义

（P > 0.05）。见表1。与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织RANKL 蛋白的表达升高

（P < 0.01）；与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组RANKL蛋白的表达均不同程度的下降（P < 0.01 或P < 0.05），其中寒痹康高剂量组下降最明显，寒痹康高剂量组与MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。上述结果提示，寒痹康汤能下调CIA大鼠骨组织中的RANKL表达，其改善CIA大鼠骨质疏松的作用可能与下调骨骼肌RANKL的表达有关。

3.2 寒痹康汤对CIA大鼠骨组织RANK表达水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织RANK mRNA的表达升高（P < 0.01）；与对模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组RANK mRNA的表达均不同程度的下降（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康汤高剂量组下降最明显；但寒痹汤高剂量组与MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织RANK蛋白的表达升高（P < 0.01）；

与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组RANK蛋白的表达均不同程度的下降（P < 0.01 或P < 0.05），寒痹康汤高剂量组下降最明显；但寒痹康汤中剂量组、寒痹康汤高剂量组与MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。上述结果提示，寒痹康汤能下调CIA大鼠骨组织中RANK的表达，其改善CIA大鼠骨质疏松的作用可能与下调骨骼肌RANK的表达有关。

3.3 寒痹康汤对CIA大鼠骨组织OPG表达水平的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织OPG mRNA的表达下降（P < 0.01）；与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组OPG mRNA的表达均不同程度的升高（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康汤高剂量组升高最明显；但寒痹康汤高剂量组与MTX组比较，差异无统计学意义

（P > 0.05）。见表3。与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨组织的OPG蛋白的表达下降（P < 0.01）；

与模型对照组比较，寒痹康汤各剂量组和MTX组的OPG蛋白的表达均不同程度的增加（P < 0.01或

P < 0.05），其中寒痹康汤高剂量组增加最明显；但寒痹康汤高剂量组与MTX组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图3。上述结果提示，寒痹康汤能上调CIA大鼠骨组织中OPG的表达，其改善CIA大鼠骨质疏松的作用可能与上调骨骼肌OPG的表达有关。

4 讨 论

RA的基本病理特征是炎症性滑膜炎伴关节软骨和骨的破坏，破骨细胞及其功能增强是导致骨质疏松的主要原因。研究表明，破骨细胞的大量形成和激活尚与RA关节软骨及骨破坏密切相关[3]，RANKL/RANK/OPG系统是与破骨细胞分化及活化过程密切相关的细胞因子，包括核转录因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）和护骨素（osteoprotegerin，OPG）。RANKL的主要生物活性为促进破骨细胞及前体细胞的分化、成熟和活化，阻止破骨细胞凋亡[4]。其活性的高低决定破骨细胞介导的骨质破坏程度，是炎性关节疾病骨质破坏过程中最重要的因素[5]。OPG抑制骨吸收是其最显著的作用。OPG竞争性与RANKL结合，封闭RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞分化、成熟，OPG/RANKL比值是破骨细胞分化诱导的决定性因素。

RANKL和OPG是RA发病过程中的关键调节因子。在RA中，活化的T淋巴细胞通过RANKL介导滑膜巨噬细胞向破骨细胞分化，引起骨丢失。在实验动物模型中，炎症部位多种细胞因子诱导成骨细胞/骨髓基质细胞表达RANK，其与RANKL结合后，通过细胞内信号转导激活核转录因子-κB（NF-κB）或活化c-Jun氨基末端激酶，调节基因表达，促进破骨细胞前体细胞分化，从而诱导破骨细胞形成，导致骨质破坏[6]。有文献报道，在佐剂性关节炎动物模型中，炎症活动部位可检测到RANKL的表达且与增加破骨细胞生成活化相一致，从而导致严重的骨与关节破坏，给予OPG可抑制骨关节的破坏[7]。Coetzee等[8]认为，骨髓微环境中OPG/RANKL比值可能决定了活化破骨细胞的活性，从而影响骨吸收率及骨密度。OPG可阻止RANKL引起的骨质疏松，但不抑制炎症反应而减轻关节肿胀。OP在RA患者中普遍存在，而且是RA患者骨和关节侵犯的一种早期表现。Pettit等[9]研究发现，在RA患者骨关节中RANKL的表达相对OPG更局限，大多分布于破骨细胞介导的骨质破坏处，即关节面血管翳与骨的交界处。由此可见，破骨细胞及调节破骨细胞功能的OPG/RANKL系统与骨质疏松、RA的骨破坏有着密切的联系。

RA属中医学“痹病”范畴，《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”《素问·评热病论》曰：“邪之所凑，其气必虚。”痹病的发生与正气亏虚及感受风寒湿之邪有关，其治疗当以扶正祛邪为原则。寒痹康汤是笔者治疗寒湿型活动期RA的经验方，由补肾及抗风湿药物组成，具有补益肝肾、益气血、祛风除湿、蠲痹止痛的作用。笔者在临床上运用寒痹康汤治疗寒湿型RA患者，发现其能改善患者关节疼痛、肿胀、压痛、晨僵等症状，能使升高的红细胞沉降率、C-反应蛋白、类风湿因子、免疫球蛋白等下降或恢复正常，无明显毒副作用[10]。临床研究还表明，寒痹康汤能降低RA继发骨质疏松患者的骨源性碱性磷酸酶水平，提高血钙及骨密度，可明显改善临床症状、骨质疏松及骨代谢状况[11]。动物实验表明，寒痹康汤能降低CIA大鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL）-6、IL-1β、NF-κB、血管内皮细胞生长因子的水平[12-14]。而这些细胞因子在RA的发病、发展过程当中起到非常重要的作用。

本研究结果发现，经寒痹康汤治疗后，CIA大鼠骨组织RANKL mRNA、RANK mRNA表达水平均相应降低，OPG mRNA表达水平升高，表明寒痹康汤可以通过影响RANKL/RANK/OPG系统，从而达到治疗RA及骨质疏松并发症的目的，是其治疗RA的作用机制之一。

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收稿日期：2015-09-14；修回日期：2015-10-28