从Wnt/β—catenin信号通路探讨透骨消痛胶囊对关节软骨的保护作用吴追乐

曾建伟　陈星强　陈春蓉　吴广文　庄志强　林如辉　尤玉莹　郑春松

【摘 要】目的：从Wnt/β-catenin信号通路观察透骨消痛胶囊对大鼠膝骨关节炎关节软骨的保护作用。方法：60只健康清洁级2月龄雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、模型对照组和透骨消痛胶囊组，每组20只。模型对照组和透骨消痛胶囊组采用质4%木瓜蛋白酶双膝关节腔注射，成功复制骨关节炎模型后，透骨消痛胶囊组给予透骨消痛胶囊287.5 mg·kg-1，正常对照组和模型对照组给予相同剂量的生理盐水。给药2个月后，采用Western blot法观察各组关节软骨中含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5（ADAMTS-5）、Wnt-4、β-catenin和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达。结果：与正常对照组比较，模型对照组ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表达升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，透骨消痛胶囊组ADAMTS-5、Wnt 4、β-catenin和MMP-13表达降低（P < 0.05）。结论：透骨消痛胶囊对关节软骨的保护作用与其降低Wnt/β-catenin信号通路表达相关。

【关键词】 骨关节炎，膝；透骨消痛胶囊；Wnt/β-catenin信号通路；体内实验；大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.12.001

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the protective effect of Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）

on knee articular cartilage of rats from Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：Sixty healthy two-month male SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group （TXJ group），20 rats in each.The model control group and the TXJ group were given double knee joint cavity injection with 4% papain.After the osteoarthritis models were successfully established，the TXJ group was given Tougu Xiaotong Jiaonang 287.5 mg·kg-1，while the normal control group and the model control group were given the same dose of physiological saline.After 2 months of administration，the Western blot method was used to observe the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，

β-catenin and MMP-13 in articular cartilage of three groups.Results：Compared with the normal control group，the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，β-catenin and MMP-13 in the model control group increased

（P < 0.05），while compared with the model group，the expressions of ADAMTS-5，Wnt-4，β-catenin and MMP-13

in the TXJ group decreased（P < 0.05）.Conclusion：The protective effect of Tougu Xiaotong Jiaonang on articular cartilage is correlated with the reduction of the Wnt/β-catenin signaling pathway expression.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；

Tougu Xiaotong Jiaonang（透骨消痛胶囊）；

Wnt/β-catenin signaling pathway；experiment in vivo；rats

透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎和肿节风组成，具有补肾柔肝和活血祛风的功效[1]，临床上用于治疗早、中期膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）[2]。前期研究显示，透骨消痛胶囊能缓解4%木瓜蛋白酶所致大鼠软骨组织超微结构的异常变化，改善软骨下骨胶原纤维和钙磷结晶的排列，抑制潮线复制和软骨基质中Ⅱ型胶原的降解，上调软骨生长因子骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达，从而延缓关节软骨的退变[3-4]；

并可以上调LC3 I/II、ULK1和Beclin1蛋白的表达水平，提高细胞自噬的活性，保护软骨细胞等[5]；

而Wnt/β-catenin信号转导通路在骨关节炎发病机制中起着重要作用[6]，其颗粒剂的体外实验证实了对此信号转导通路具有调控作用，但其相关的体内实验未见报道[7]。因此，本研究观察大鼠KOA的关节软骨中Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白的表达，探讨透骨消痛胶囊对其的调控作用，进一步阐明其保护关节软骨的机制，现总结

如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康清洁级2月龄雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCKK（沪）2012-0002。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级实验动物环境设施（合格证号：医动学第23-016号）。实验动物的处置按照2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2 实验药物 透骨消痛胶囊为福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂，临床用量为每粒460 mg，每次3粒，每日2次。批准文号：闽制字Z20100006。

1.3 实验试剂和仪器 木瓜蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司）；生理盐水（福州海王福药制药有限公司）；RIPA裂解液（强）、PMSF（100 mM）、

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）、彩色预染蛋白质分子量标准、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、20×TBS、Western封闭液、SDS-PAGE电泳缓冲液、Western 一抗稀释液、Western 二抗稀释液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物有限公司）；Anti-WNT4、Anti-MMP13、Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP）、Goat F（ab'）2 Anti-Mouse IgM mu chain （HRP）、Anti-ADAMST-5（美国abcam公司）；Anti-beta Actin、Anti-beta Catenin（北京博奥森生物技术有限公司）；半干转印系统（新型快速）、电泳仪、化学发光成像系统（美国Bio Rad公司）等。

2 方 法

2.1 动物分组及模型建立 将60只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组和透骨消痛胶囊组，每组20只。模型对照组和透骨消痛胶囊组从实验开始的第1，4，7天分别采用4%木瓜蛋白酶双膝关节腔注射[8]，建立KOA大鼠模型。

2.2 给药方法 造模2周后，切取胫骨平台，利用HE染色法[9]，观察正常对照组、模型对照组和透骨消痛胶囊组的软骨组织形态，进行模型鉴定。模型制备成功后，参照药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[10]，透骨消痛胶囊组每日给予透骨消痛胶囊287.5 mg·kg-1，正常对照组、模型对照组则给予同剂量的生理盐水灌胃。

2.3 检测指标及方法 分别给予生理盐水和透骨消痛胶囊灌服2个月，刮取各组软骨组织，剪碎后经匀浆器充分研磨，用裂解液裂解提取蛋白，经BCA测定浓度。加入5×loading buffer，100 ℃ 5 min

变性。各组每孔按50 μg上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离后，半干湿转法将蛋白转至PVDF膜上，均在室温用质量分数为5%的脱脂奶粉封闭1 h，分别加入β-Actin（1∶1000）、MMP-13（1∶3000）、β-catenin（1∶500）、Wnt-4（1∶500）和ADAMST-5（1∶1000）一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入对应的二抗（1∶3000），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加ECL发光剂，凝胶成像系统扫描，计算目的蛋白条带灰度值与内参蛋白β-Actin条带灰度值

的比值。

2.4 统计学方法 研究中软骨组织的蛋白提取、含量检测均经独立重复实验3次，采用 SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 造模情况 造模2周后，正常对照组软骨表面光滑，四层结构清晰，软骨分布均匀，潮线完整；模型对照组软骨表面凹凸不平，表层和深层软骨细胞数量明显减少，部分软骨细胞固缩，偏于一侧，有明显的炎性细胞渗出。病变符合骨关节炎的基本变化。见图1。

3.2 关节软骨中ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和

MMP-13的含量 给药2个月后，与正常对照组比较，模型对照组ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和MMP-13表达升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，透骨消痛胶囊组ADAMTS-5、Wnt-4、β-catenin和MMP-13表达降低（P < 0.05）。见图2、图3。

4 讨 论

KOA是一种以关节软骨的退行性病变和继发性骨质增生为主要病变的疾病。有研究表明，木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，能分解软骨基质的蛋白多糖；蛋白多糖的丢失可减弱软骨基质对软骨细胞的保护作用，导致软骨细胞退变以致破坏、软骨降解，即其在维持软骨的硬度和弹性方面具有重要作用，已经成为判断软骨退变的指标之一[11-12]。而以ADAMTS-4和ADAMTS-5为主的蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖，且去除ADAMTS-5活性能对抗蛋白多糖的分解，但是，去除ADAMTS-4活性无此作用[13]。因此，本研究以关节腔注射木瓜蛋白酶复制大鼠KOA模型，检测给药2个月后各组软骨中ADAMTS-5的含量，反映软骨退变程度。结果发现，透骨消痛胶囊能降低KOA关节软骨中ADAMTS-5的含量，提示其减少蛋白多糖的降解，从而减轻关节软骨的损伤。

为了进一步研究透骨消痛胶囊对关节软骨的保护作用，笔者研究了其对软骨细胞生长、分化和成熟相关的Wnt/β-catenin信号通路影响[14]。前期研究表明，在Wnt/β-catenin信号通路中，Wnt-4过度表达引起β-catenin持续表达，导致生长板软骨细胞肥大和向终端分化。而且，在OA损伤软骨和退变的软骨细胞中，β-catenin表达增多，会刺激MMPs的分泌[15]。其中，MMP-13可直接降解软骨基质中最具特征的Ⅱ型胶原，在关节软骨的破坏中起到重要作用，可作为软骨破坏性的标志性分

子[16]。而且，它也是Wnt/β-catenin（下转第31页）

（上接第7页）信号转导通路的下游分子[14，17]。本研究检测给药2个月后各组软骨中Wnt-4、β-catenin和MMP-13的含量，结果显示，透骨消痛胶囊能降低软骨中Wnt-4、β-catenin和MMP-13的表达，提示透骨消痛胶囊保护关节软骨与Wnt/β-catenin信号转导通路有关。

本研究以透骨消痛胶囊为干预药物，以大鼠KOA为模型，以软骨保护为主线，在研究反映软骨退变程度指标ADAMTS-5的基础上，旨在研究透骨消痛胶囊保护关节软骨的机制，证实了透骨消痛胶囊能降低ADAMTS-5的含量，减少蛋白多糖的降解，保护关节软骨，其作用机制之一为透骨消痛胶囊对Wnt/β-catenin信号通路的多靶点调控作用。

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收稿日期：2015-07-29；修回日期：2015-10-21