真菌（1—3）—β—D葡聚糖体外检测影响因素探讨

向成玉 丁银环 景翠源

【摘要】 目的：探討念珠菌细胞壁成分（1-3）-β-D葡聚糖检测的体外影响因素;方法：实验组：将白色假丝酵母菌用正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水稀释为0.5麦氏单位（含白色念珠菌1X10⁷CFU/ml），对照组：将上述各液稀释100倍，采用免疫沉淀试验（G试验）检测其10次（1-3）-β-D葡聚糖含量，并进行体外培养，以此探讨生理盐水、抗真菌药物对（1-3）-β-D葡聚糖体外检测的影响;结果：实验组中，正常血浆葡聚糖含量为（92.5土14.2） ug/l，蒸馏水组含量为（94.5土15.2） ug/l，生理盐水组含量为为（93.6土14.8） ug/l，两性霉素B组含量为（95.5土16.2） ug/l，氟康唑组（97.3土16.8） ug/l，经统计检验组内结果间无显著性差异（P>0.05）。对照组中：正常血浆含量为（6.8土2.7） ug/l，蒸馏水组含量为（6.1土2.4） ug/l，生理盐水组含量为为（7.3土2.0） ug/l，两性霉素B含量为（6.8土2.5） ug/l，氟康唑组（6.7土2.8）ug/l，经统计检验组内间结果无显著性差异（P>0.05）。实验组与对照组比较有显著差异（p<0.001）。结论：体外真菌细胞壁（1-3）-β-D葡聚糖含量变化与液体介质的无关，与真菌治疗药物无关，与念珠菌数量密切相关。

关键词   （1-3）-β-D葡聚糖  体外检测  两性霉素B 氟康唑

[Abstract]  ObjectiveTo study the influence factors of the detection of fungal cell wall 1，3-β-D-glucan in virto.Methods The experimental group：  the Candida albicans were diluted with normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline as 0.05 McIntosh unit （containing candida albicans 1X107CFU/ml）. The control group： diluting the precursory solutions to 100 times. Measuring the concentration of 1，3-β-D-glucan in the solutions 10 times through G test ， and culturing the Candida albicans in each solution in virto to study the influence of antifungal drugs， physiological saline on the testing of 1，3-β-D-glucan in vitro.Results The experimental group： the concentration of 1，3-β-D-glucan in normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline were （92.5土14.2） ug/l，（94.5土15.2） ug/l， （93.6土14.8） ug/l，（95.5土16.2） ug/l， and （97.3土16.8） ug/l. The differences in the group are not significant by statistics test （P > 0.05）. The control group： the concentration of 1，3-β-D-glucan in normal plasma， Pyrogen-free distilled water， 0.9% of physiological saline， 0.02% amphotericin B saline， and 0.75% fluconazole saline were （92.5土14.2） ug/l，（94.5土15.2） ug/l，（93.6土14.8） ug/l，（95.5土16.2） ug/l， and （97.3土16.8） ug/l. The differences in the group are not significant by statistics test （P > 0.05）. There were significant differences between the experimental group and the control group （P < 0.001）.Conclusion  The concentration of Fungal 1，3-β-D-glucan in virto has noting to do with liquid mediums or antifungal drugs， but is closely related to the number of candida.

Key words：  1，3-β-D-glucan; detection in virto;  amphotericin B; fluconazole

真菌（1-3）-β-D葡聚糖的检测是诊断深部真菌感染的快速准确的方法，其特异性和敏感性已经得到一致的公认^[1.2]。但是据报道生物大分子和头孢菌素等对检测结果有影响^[1.2]，常常出现假阳性假阴性结果。为了观察体外检测过程中是否受到介质的影响。我们选择了正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水对白色念珠菌进行稀释，以观察治疗用药两性霉素B和氟康唑对体外检测结果的影响。

1材料与方法

仪器与试剂：MD-80型微生物动态快速检测系统，T01智能恒温仪，冰浴槽以及GKT109动态真菌检测试剂盒（定量），均由北京金山川科技发展公司提供。

待测液制备：将白色假丝酵母菌用正常血浆、无热原蒸馏水、0.9%的生理盐水、0.02%两性霉素B生理盐水和0.75%氟康唑生理盐水稀释为0.5麦氏单位（含白色念珠菌1X10⁷CFU/ml）。取上述制备好的各样本100ul，加入样品处理液中混匀后70℃保温10分钟取出后立刻放入冰水浴中即为待测样品。细菌培养取每种液体10ul也倾注平板接种，根据生长的菌落进行计算。

测定分析：取待测样品200ul直接加入反应主剂中，溶解后使用微量加样器转移至10X75mm标准玻璃反应管中，不要产生气泡。插入MD-80微生物快速动态测定系统中进行反应，反应结束后由标准曲线自动计算出待测血浆中葡聚糖含量。操作过程中注意避免微生物及细菌污染。

统计分析：测定结果用spss17.0统计软件t检验进行分析，（1-3）-β-D葡聚糖含量以均数± 标准差表示，P<0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1、两组（1-3）-β-D葡聚糖检测结果

实验组中，正常血浆葡聚糖含量为（92.5土14.2） ug/l，蒸馏水组含量为（94.5土15.2） ug/l，生理盐水组含量为为（93.6土14.8） ug/l，两性霉素B组含量为（95.5土16.2） ug/l，氟康唑组（97.3土16.8） ug/l，经统计检验组内结果间无显著性差异（P>0.05）。对照组中：正常血浆含量为（6.8土2.7） ug/l，蒸馏水组含量为（6.1土2.4） ug/l，生理盐水组含量为为（7.3土2.0） ug/l，两性霉素B含量为（6.8土2.5） ug/l，氟康唑组（6.7土2.8）ug/l，经统计检验组内间结果无显著性差异（P>0.05）。实验组与对照组比较有显著差异（p<0.001）.（见表1）

2.2、两组白色念珠菌菌落数检测结果

实验组中，正常血浆组含量为100万个CFU/L，蒸馏水组含量为100万个CFU/L，生理盐水组含量为为100万个CFU/L，两性霉素B组含量为0个CFU/L，氟康唑组0个CFU/L，经统计检验组内结果间无显著性差异（P>0.05）。对照组中：正常血浆组含量为2000个CFU/L，蒸馏水组含量为2000个CFU/L，生理盐水组含量为为2000个CFU/L，两性霉素B含量为0个CFU/L，氟康唑组0个CFU/L，经统计检验组内间结果无显著性差异（P>0.05）。实验组与对照组比较有显著差异（p<0.001）。（见表2）

表1    两组（1-3）-β-D葡聚糖浓度（pg/l）

组    别      实验组β-D（X土S）      對照组β-D（X土S）

血    浆      92.5土14.2※▲           6.8土2.7

蒸 馏 水      94.5土15.2※▲           6.1土2.4

生理盐水      93.6土14.8※▲           7.3土2.0

两性霉素      95.5土16.2※▲           6.8土2.5

氟 康 唑     97.3土16.8※▲           6.7土2.8

※组内比较结果无显著差异（p>0.05），▲组间比较结果有显著差异（P<0.05）

表2 两组白色念珠菌菌落数（CFU/L）

组  别              实验组（万个CFU/L）        对照组（个CFU/L）

血浆组                    100                  1900

蒸馏水                    100                  1800

生理盐水                  100                  2000

两性霉素                  0                    0

氟康唑                    0                    0

※组内比较结果无显著差异（p>0.05），▲组间比较结果有显著差异（P<0.05）

3讨论

（1-3）-β-D葡聚糖是一种多糖，普遍存在于除接合菌外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁干重的50%以上，尤其在酵母样真菌中含量最高，其他微生物如细菌、病毒及动物、人体细胞均缺乏此成分。（1-3）-β-D葡聚糖由D.葡萄糖聚合而成，以β（1-3）糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状β（1-6）糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链^[3]， 血浆（1-3）-β-D葡聚糖检测常用免疫沉淀试验（G试验）方法。

某些情况可干扰检测结果而出现假阳性及假阴性，本研究中所需器皿均行灭菌、去热源处理，操作中坚持无菌原则，所选溶解介质均排除了干扰因素，检测结果可靠。

结果发现，实验组内与对照组组内葡聚糖体外检测结果无显著差异，表明葡聚糖体外检测结果与检验时的液体介质无关。组间结果差异有显著性，表明与念珠菌菌落數显著相关。在本研究中，白色念珠菌菌落数小于10000 CFU/L，其（1-3）-β-D葡聚糖浓度体外检测结果低于参考值7.5 pg/ml。可能的原因是本实验时念珠菌细胞壁成分释放不充分，而且在体外环境和动物环境中释放方式的不确定性，尚需在动物模型的感染方面进行试验。

参考文献

[1]. 李岷，吴绍熙，一种深部真菌早期诊断的新方法-测定真菌细胞壁成分葡聚糖。国外医学皮肤性病学分册。1998，24（6）：344-346。

[2]. 张建芳，徐修礼，樊新等 ，深部真菌感染患者血浆葡聚糖检测的临床意义。中华医院感染学杂志，2005.15（3）：354-355。[3]吕沛华，赵蓓蕾， 施毅等. （1-3）-β-D葡聚糖检测诊断侵袭性真菌感染的临床价值.中华结核和呼吸杂志.2007 ，30（1）：31-34.