链霉菌Js—1T发酵条件及其对疣孢霉病的防治效果研究

李兵兵 温志强

摘要 [目的]探讨链霉菌Js-1T的发酵条件及防治效果。[方法]通过单因素试验优化链霉菌菌株Js-1T防治疣孢霉病的发酵培养基和条件，测定其发酵液对疣孢霉菌（Mycogone perniciosa）的田间防治效果。[结果] Js-1T菌株的最佳培养基配方为：甘露糖30.0 g，KNO3 20 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳发酵条件为：30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶装液量为100 ml。发酵液对疣孢霉菌的田间防治效果显著，对Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类3个类群疣孢霉菌引起的疣孢霉病的防治效果分别达68.77%、83.84%、85.62%。[结论]链霉菌Js-1T在疣孢霉病防治上具有很好的应用前景。

关键词 链霉菌Js-1T；发酵优化；疣孢霉菌；生物防治

中图分类号 S436.46 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-094-03

Optimization on Fermentation Conditions of Streptomyces Js-1T and Inhibition of the Fermented Liquid against Mycogone perniciosa

LI Bing-bing1，2， WEN Zhi-qiang1*

（1. Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou， Fujian 350002； 2. Huaian Center for Disease Control and Prevention，Huaian， Jiangsu 223001）

Abstract [Objective] The aim was to study fermentation conditions and control effect of Streptomyces Js-1T. [Method] In order to increase the productivity of activities substance of strain Js-1T， the composition of fermenting solution and fermenting conditions were optimized by single factor. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa was also tested. [Result] The optimum fermenting solution were Mannose 30.0 g， KNO3 2.0 g， MgSO4 1.5 g， K2HPO4 1.0 g， NaCl 0.1 g， and water 1 000 ml； the optimal fermenting conditions were temperature 30 ℃， pH=8， and 100 ml liquid medium in 250 ml flake. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ were 68.77%， 83.84% and 85.62%， respectively. [Conclusion] Streptomyces strain Js-1T had certain application prospect in control of Mycogone perniciosa.

Key words Streptomyces strain Js-1T； Fermenting optimization； Mycogone perniciosa； Biological control

雙孢蘑菇疣孢霉病是由疣孢霉菌侵染引起的一种世界性病害[1-2]，近年来我国双孢蘑菇疣孢霉病发生日趋严重，已成为制约我国双孢蘑菇生产发展的重要因素之一[3]。目前，疣孢霉病主要使用化学药剂来防治，但化学药剂容易造成农药残留和环境污染。目前利用生物防治控制疣孢霉病的研究较少，蔡少芬等[4]分离到一株对疣孢霉菌有抑制作用的枯草芽孢杆菌，王勇等[5]研究发现裂褶菌发酵液对疣孢霉菌丝生长的抑制率达48.96%。Js-1T菌株是从银耳栽培料中分离得到的一株链霉菌，初步研究发现该菌株对疣孢霉菌具有很强的抑制作用。笔者对Js-1T菌株的发酵培养基和条件进行了初步优化，并测定了发酵液对疣孢霉菌的防治效果，以期为Js-1T菌株的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。

链霉菌Js-1T菌株，从银耳杨梅霜病发病菌筒分离获得并保存于中国典型培养物保藏中心（保藏号：CCTCCM2011365）。

疣孢霉菌、双孢蘑菇2796菌株均由福建农林大学菌物研究中心提供。

1.1.2 培养基。

葡萄糖马铃薯培养基（PDA）：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，水1 000 ml，pH自然。

Bennett培养基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏1.0 g，牛肉浸膏1.0 g，酶水解酪素2.0 g，水1 000 ml。

发酵基础培养基：碳源25.0 g，氮源3.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml，pH 7。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化。将Js-1T菌株接种于液体Bennett培养基中，在转速为160 r/min、温度为30 ℃的恒温摇床中培养4 d。吸取50 μl培养好的液体菌种涂布于PDA平板上，30 ℃培养7 d，供试验用。

1.2.2 发酵液活性测定。以疣孢霉菌作为指示菌，采用生长速率法[5-6]测定发酵液的活性。用直径为0.22 μm的一次性细菌过滤器过滤发酵液，取13 ml上述无菌发酵液添加到100 ml温度为40 ℃左右的固体PDA中，充分混合均匀后倒平板。待培养基凝固后，接种直径为1 cm的疣孢霉菌菌饼，每个处理5次重复。同时，以添加13 ml无菌水的培养基作为对照。25 ℃下培养，待空白对照接近长满培养皿时，测量菌落半径，并计算抑菌率。

抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-原菌饼直径）×100%[7]

1.2.3 种子培养液的制备。用无菌接种环挑取Js-1T菌株的孢子接到装有100 ml发酵基础培养基的250 ml三角瓶中，160 r/min、30 ℃培养4 d。

1.2.4 碳源筛选。在发酵基础培养基中分别添加2%（W/V）的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘油作为唯一碳源，按6 ml/100 ml接种量接种种子发酵液，30 ℃培养14 d。按照“1.2.2”方法测定发酵液的抑菌活性。

1.2.5 氮源筛选。在发酵基础培养基中分别添加0.3%（W/V）的蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、酵母提取物作为唯一氮源，按6 ml/100 ml接种量接种种子发酵液，30 ℃培养14 d。按照“1.2.2”方法测定发酵液的抑菌活性。

1.2.6 碳源添加量试验。将“1.2.4”筛选出的碳源按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（W/V）添加量加入培养基，按6 ml/100 ml接种量接种种子发酵液，30 ℃培养14 d。筛选出最适碳源添加量。

1.2.7 氮源添加量试验。将“1.2.5”筛选出的氮源按0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%（W/V）添加量加入培养基，按6 ml/100 ml接种量接种种子发酵液，30 ℃培养14 d。筛选出最适氮源添加量。

1.2.8 温度对发酵液活性的影响试验。以筛选出的碳源、氮源按照最适添加量配制培养基，按100 ml/250 ml装液量接种6 ml种子发酵液，分别测定20、25、28、30、35 ℃条件下发酵液的抑菌活性。

1.2.9 初始pH对发酵液活性的影响试验。将最适培养基的pH分别调节至5、6、7、8、9，接种6 ml种子发酵液，30 ℃恒温培养14 d。培养结束后将发酵液的pH调至中性，测定发酵液的活性。

1.2.10 装液量对发酵液活性的影响试验。分别将50、100、150、200 ml的培养基装入250 ml三角瓶中。按选出的最佳接种量接入种子发酵液，30 ℃恒温培养14 d。测定发酵液的活性。

1.2.11 发酵液对3个类群疣孢霉菌的田间防治试验。

分别用3个类群疣孢霉菌的孢子悬液感染双孢蘑菇覆土，然后用Js-1T菌株发酵液处理覆土，每个处理设置20 m2的出菇面积，10 d后按5点取样法统计新长出双孢蘑菇子实体的病菇和健菇的数目，计算发病率和防治效果。

2 结果与分析

2.1 碳源筛选 由图1可知，甘油作为碳源时，发酵液对疣孢霉抑制作用最低（2.01%）；甘露糖作为碳源时，发酵液抑菌活性最高（23.43%）；其余依次为麦芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖。

2.2 氮源筛选 由图2可见，在供筛选的4种氮源中，（NH4）2SO4、KNO3 2种无机氮源比有机氮源酵母提取物和蛋白胨抑菌效果好，氮源为KNO3时Js-1T菌株发酵液的抑菌活性最强，抑菌率为15.20%。

2.3 碳源添加量 碳源添加量对发酵液的抑菌活性有显著影响（图3），添加量在10～30 g/L时，随着添加量的增加，发酵液抑菌活性逐渐增强，添加量为30 g/L时发酵液抑菌活性达到最高（17.64%）。继续添加甘露糖，发酵液抑菌活性开始下降。

2.4 氮源添加量 根据“2.2”试验结果选择KNO3作为氮源，添加量为2.0 g/L时，发酵液对疣孢霉抑菌效果最佳，抑菌率为20.76%（图4），之后随添加量的增加，发酵液的抑菌活性开始降低。

2.5 温度对Js-1T菌株发酵液抑菌活性的影响

由图5可知，30 ℃为Js-1T菌株发酵产生活性物质的最佳温度，此时发酵液的抑菌活性为26.28%。

2.6 初始pH对Js-1T菌株发酵液抑菌活性的影响

初始pH对Js-1T菌株发酵液的抑菌活性有显著影响。在酸性和强碱环境中发酵液的抑菌活性较低，初始pH为8时发酵液的抑菌活性最强，但当发酵液初始pH等于9時，发酵液对疣孢霉几乎没有抑制作用（图6）。

图6 初始pH对发酵液抑菌活性的影响

2.7 装液量对Js-1T菌株发酵液抑菌活性的影响 在250 ml三角瓶中装100 ml发酵液时，对疣孢霉菌的抑制活性最强，再增加装液量，抑菌活性则降低（图7），说明Js-1T菌株发酵时对氧气需求较高。因此，Js-1T菌株发酵时的装液量选择100 ml/250 ml。

图7 装液量对发酵液抑菌活性的影响

2.8 发酵液对3个类群疣孢霉菌的田间防治效果

由表1可知，Js-1T菌株发酵液使双孢蘑菇的疣孢霉病发病率明显降低。其中，对疣孢霉Ⅰ类引起的栽培中双孢蘑菇2796的防治效果相对较低，为68.77%，对Ⅱ类和Ⅲ类疣孢霉病的防治效果较高，分别达83.84%、85.62%。由此可见，Js-1T菌株发酵液在孢霉菌的防治方面具有很好的应用价值。

3 结论与讨论

通过单因素筛选初步确定了Js-1T菌株发酵的最佳培养基配方为：甘露糖30.0 g，KNO3 2.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4

1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳发酵条件为：温度30 ℃，

pH=8，250 ml三角瓶中装100 ml发酵液。田间防治试验结果表明，Js-1T菌株发酵液对Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类3个类群疣孢霉菌引起的栽培中双孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果显著，防治效果分别达68.77%、83.84%、85.62%。发酵是一个十分复杂的过程，许多因素会影响到最终试验结果[6-7]。该研究通过单因素试验方法确定了Js-1T菌株的最佳发酵条件，提高了Js-1T菌株代谢产生拮抗物质的能力，但是还需通过正交或响应面法进一步优化发酵条件。

自1943年Waksman首先发现链霉菌可以产生链霉素以来，放线菌已经成为公认的新抗生素产生菌的主要来源[8]。目前已经发现的抗生素有80%以上是由放线菌产生的，其中又以链霉菌属的菌株产生的最多[9]。农用抗生素作为抗生素的一类，具有活性高、对使用环境的污染少、在环境中不易积累、来源广、可再生等优点[10]，在农业生产中有很好的应用前景。Js-1T菌株是从银耳发病菌筒中分离到的链霉菌，并且福建农林大学菌物研究中心已经利用多相分类鉴定该菌株为链霉菌属的一个新种，因此，该菌株产生新的抑菌活性物质的可能性较高。从Js-1T菌株发酵液中提取、鉴定有效活性物是下一步研究的重点。此外，利用链霉菌防治疣孢霉病的研究目前尚未见报道，该试验结果对后续发酵中试放大、有效活性物质的分离纯化以及疣孢霉病的防治具有重要意义。

参考文献

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责任编辑 刘月娟 责任校对 李岩