温度与放置时间对产前筛查标本的影响

单群达 黄珍珍 陈鹏龙 蓝海鹰 靳春雷 陈莉莉 徐雪琴

[摘要] 目的 探讨在产前筛查血清标本离心前放置时间及温度对游离人绒毛膜促性腺激素β亚基（free β-hcg）、甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇（uE3）测定结果的影响。 方法 额外收集产前筛查标本全血6 mL，分装至5支試管（水浴组加做一支用于对照），在室温（23℃～25℃）或水浴箱（35℃～37℃）下分别放置0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后离心分离血清，以室温下0.5 h分离血清的标本作为对照组，各组与对照组分别进行比较分析。 结果 置室温组样本free β-hcg以约每小时0.9%的速率上升，AFP、uE3与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；水浴条件下free β-hcg以约每小时10.9%的速率迅速升高，AFP以每小时0.6%的速率上升，uE3则以每小时0.5%的速率降低。 结论 室温条件下，2 h内分离对结果影响较小，水浴条件对free β-hcg结果有严重影响，对其余两项也存在影响。产筛标本应尽量在较低温度下处理，建议不要对产前筛查标本进行37℃水浴处理。

[关键词] 分析前变异；产前筛查；质量控制；温度

[中图分类号] R715.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）30-0011-04

Effect of temperature and the duration on second-trimester serum markers

SHAN Qunda1 HUANG Zhenzhen1 CHEN Penglong1 LAN Haiying1 JIN Chunlei1 CHEN Lili1 XU Xueqin2

1.Prenatal Diagnosis Center， Lishui Maternity and Child Health Care Hospital， Lishui 323000， China； 2.Central Laboratory， the Central Hospital of Wenzhou City， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To examine the effect of the duration of storage of whole blood at different controlled temperatures on the concentrations of serum free-β-human chorionic gonadotropin （f-βhCG）、Alpha fetoprotein（AFP） and unconsecrated estriol（uE3）. Methods We additionally collected 6 mL of whole blood of prenatal screeningspecimen， respectively put into 5 vacuum tubes（The water bath group should make an additional piece for comparison）， placed at room temperature （23℃-25℃） or in the water bath box （35℃-37℃） for 0.5 h， 2 h， 4 h， 6 h， 8 h， after that， made a centrifugal separation to separate the blood serum， taken the specimen of blood serum separated atroom temperature for 0.5 h as the control group， and respectively compared and analyzed each group with the control group. Results In the room temperature group， f-βhCG had a rate of 0.9% per hour increasing. No significant difference was found in AFP and uE3（P>0.05）. In the 37℃ group， f-βhCG had a rate of 10.9% per hour increasing rapidly. AFP had a rate of 0.6% per hour increasing， and uE3 had a rate of 0.5% per hour decreasing. Conclusion Under the condition of room temperature， to separate in 2 hours has a less influence on the result， and the water bath condition has a serious effect on the results of free β-hcg and the other two items. The prenatal screening specimen should be processed at a lower temperature as far as possible， and it is not suggested to make a water bath treatment of 37℃ for the prenatal screening specimen.

[Key words] Preanalytical variation； Prenatal screening； Quality control； Temperature

产前筛查室通过定量测定孕妇血液中与妊娠有关的生化指标，对胎儿患有先天异常的风险进行筛查评估。国内目前采用的中孕期筛查方案为二联法或三联法。其原理为测定母体血清free β-hcg、AFP、uE3（只在三联法中测定）的值，结合孕周、年齡、体重等因素，运用风险评估软件对胎儿21三体、18三体及神经管畸形的风险进行评估。母体血清测定结果直接影响到风险的评估，而其结果的可靠性很大部分来自于分析前。目前产筛中心的标本很大一部分来自于其下面的采血点，该部分标本的质量参差不齐，存在较多问题。虽然已有明确的规定用于保证分析前的标本质量[1]，但对标本质量的评价迫切需要一种有效而易普及的方法。英国国家筛查委员会于2007年启动的DQASS质评及保证计划，通过周期性监测所有产筛实验室的中位数倍数（MoM）中位数（mMoM）的值及风险评估，来评价各实验室的筛查质量及效率，找出实验室可能存在的误差因素，提高筛查质量，取得了良好的效果。在国内，已有类似方案的提出，通过定期对mMoM值进行监测分析，找出造成mMoM异常波动和偏倚的因素，对中位数进行合理的调整和修正[2]，笔者认为这是目前较好的一种方法。影响mMoM值发生异常偏移的原因较多，本文着眼于标本检测的稳定性与准确性方面的研究。目前已有筛查标本测定结果受离心前放置时间[3，4]、保存温度[5]、运输[6]以及季节[7]等诸多因素的影响的报道，但均较少涉及明确的趋势性变化关系的探讨。总结后可以发现，这些文献中的影响因素均涉及到温度与标本放置时间，也即本文所要讨论的问题，其研究意义在于明确把握各项指标的变化规律，以利于找出造成mMoM异常偏移的因素，为大批量临床标本质量的评估提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年3月～2014年4月来本院进行产前筛查的孕妇60例，孕周15～20周。平均年龄（27.9±4.2）岁，平均体重为（54.3±6.1）kg。告知孕妇本实验室在保证其原本申请项目的准确及可靠的前提下，需要其对血液进行分装，并进行额外的测试。

1.2 仪器与试剂

采用Perkin Elmer 1235自动时间分辨荧光免疫分析仪进行测定，free β-hcg、AFP、uE3试剂均为WallacOy生产原装配套试剂。测定前3个月室内质控均在控。

1.3 方法

静脉采血完成后，立即收集来自生化、发光、免疫等无抗凝剂、无促凝剂管全血共60例，分装于5根与产前筛查血清学试验相同的分离胶管内（水浴组加做一支用于对照）。所有血液收集均在满足生化、发光等项目测定及复查需要的前提下进行，并不给孕妇带来额外负担。将同一孕妇血清分装后的5根试管放置于室温（30例）或37℃水浴温度下（30例），0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后离心，水浴组第6管血样置室温下0.5 h后离心用于对照，收集血清后编号密封保存于-20℃冰箱待检。为了降低多天的收集过程中室温波动对结果造成的影响，应尽量减少收集标本的天数。本实验实际收集天数为6 d，当天10时室内气温分别为：23.5℃、24.3℃、23.7℃、24.2℃、25.3℃、24.8℃。为了增加各组之间的可比性，尽量减少不同天次测量带来的系统误差，本文采用60例血清标本在同一天同一批次内完成测定的方案。

1.4 观察指标

1.4.1 37℃下进行分析 观察组，一名孕妇共有6管理论上初始值为相同的标本，第6管血样置室温下0.5 h后离心保存，做为对照。其余5管在37℃水浴下经0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分别离心，观察free β-hcg、AFP、uE3的结果随着分离时间的延迟所发生的变化。

1.4.2 室温下进行分析 观察组，一名孕妇共有5管理论上初始值为相同的标本，经0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分别离心，检测其free β-hcg、AFP、uE3的结果，以0.5 h离心分离的管为对照组，观察其余各组结果的变化规律。

1.5 统计学方法

1.5.1 37℃水浴条件下的实验 对6组数据进行单因素重复测量方差分析，在整体比较有意义的前提下，以额外设立的室温下0.5 h分离的标本为对照组，0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h分离的标本分别与对照组进行配对t检验，调整显著性水平为：α=0.05/5=0.01。

1.5.2 25℃室温条件下的实验 对5组数据进行单因素重复测量方差分析，在整体比较有意义的前提下，以0.5 h分离的标本为对照组，2 h、4 h、6 h、8 h分离的标本分别与对照组进行配对t检验，调整显著性水平为：α=0.05/4=0.013。

1.5.3 线性回归分析 计算实验组与对照组的平均相对差值[8]，并且以该值为纵坐标、以时间（h）为横坐标，进行一元一次线性回归，以更直观地描述浓度的趋向性变化。相对差值计算公式为：（实验组-对照组）/对照组，平均相对差值即相对差值累加后的均值。应用SPSS20.0统计学软件进行分析。

2 结果

2.1 水浴（37℃）下放置时间对AFP、free β-hcg、uE3的影响

37℃水浴条件下，uE3表现为下降趋势，配对t检验结果显示，2 h、4 h、6 h、8 h组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.01）。AFP表现为上升趋势，配对t检验结果显示2 h、4 h、6 h、8 h组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.01）。free β-hcg的均值表现为迅速的上升趋势，配对t检验示其0.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h组与对照组的差异均具有统计学意义（P<0.01）。见表1。平均相对差值分别为2.83%、23.02%、45.41%、61.77%、87.05%。将平均相对差值（y）与时间（x）进行一元一次线性回归，得出时间与free β-hcg的平均相对差值的回归方程为y=-0.015+0.109x（R2=0.998），表明free β-hcg的含量随着放置时间呈直线上升，其他回归方程及其相关系数见表2。

2.2 室温（23℃～25℃）下放置时间对AFP、free β-hcg、uE3的影响

室温（23℃～25℃）条件下，单因素重复测量方差分析显示AFP、uE3各组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。free β-hcg随着放置时间的增加呈缓慢上升趋势，t检验结果显示4 h、6 h、8 h组与对照组差异具高度统计学意义（P<0.01），平均相对差值分别为1.81%、3.69%、4.73%、7.72%。见表2。将平均相对差值（y）与时间（x）进行一元一次线性回归，得出时间与free β-hcg平均相对差值的回归方程为y=-0.017+0.009x（R2=0.962），其他回归方程及其相关系数见表3。

表2 室温（23～25℃）下放置时间对AFP、free β-hcg、uE3的影响（x±s）

注：组内比较以室温0.5 h分离标本为对照组，其他4个时间点分别与之进行配对t检验，调整显著性水平α=0.05/4=0.013，带*表示其有显著性差异

3 讨论

hCG是由胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，有α和β亚基组成，在体内主要以完整的形式存在，free β-hcg占总hCG的1%左右[8，9]。在室温或水浴下放置时间的延长，hCG会分解为游离hCG，导致free β-hcg的测定结果升高[3]。本文进一步计算了升高的相对差值，并进行了线性回归分析，根据斜率可知，37℃下free β-hcg以每小时10.9%的速率升高，大大地强于室温条件下每小时0.9%的上升速率。一般认为AFP为相对稳定的蛋白类物质，其结果不随放置时间的延长而发生显著性的变化[4，10，11]。本实验中AFP在室温下未发现趋向性变化，在37℃下其以约每小时0.6%的趋势上升，主要考虑为标本放置在相对高温的37℃环境中，水分挥发速率较大，标本相对浓缩导致的结果。AFP线性回归方程相关系数稍低（R2=0.936），可能是由于其相对差值较小，各种随机误差造成的影响较大引起。目前有观点认为uE3在全血状态下不稳定，容易分解[12]，也有观点认为全血中的uE3在4℃下保存结果稳定[13]。本文中uE3在室温下未发现趋向性变化，该结果与Brown LF[14]等得出的结果较一致，该篇中得出的一个结果为22℃条件下uE3在全血或血清中放置1周，其结果均稳定。uE3在37℃水浴下表现为每小时约0.5%的下降趋势。uE3的下降提示其在高温下更不稳定，容易发生降解。如果将标本水分的挥发因素考虑在内，uE3的下降速率因比本文中所报道的数值更大一点。由于uE3的cv值较其他两项检测高，并且其下降比例较小，导致回归方程相关系数较低（R2=0.777）。需要指出的是，本文中的室温组只代表了平均气温23℃左右时的情况，实际工作中，不同实验室以及季节的变化，对筛查结果的影响程度均会有差别。

中孕期唐氏妊娠母血清中free β-hcg均呈持续上升趋势，MoM值为正常孕妇的2.2～2.5倍；uE3在唐氏妊娠母体的表现为较正常水平降低，异常一般为<0.7 mom；APF在单独使用以0.5MoM为标准，检出率为20%，假阳性率5%[9]。水浴导致free β-hcg的浓度迅速升高，同时也影响AFP及uE3的稳定性，这些变化均将导致假阳性结果的增多。这意味着需进行更多不必要的羊膜腔穿刺，带来更多的胎儿损失（羊膜腔穿刺流产率约0.5%）。因此，产筛标本应在较低的室温下尽快分离，并及时保持于4℃冰箱，以尽量减少假阳性率的升高。

已有研究表明，筛查机构本部采血标本和采血点送检标本所测的AFP及free β-hcg的Median MOM不同，采血点标本free β-hcg的正偏倚尤为明显[15]。由于目前缺乏对标本质量的评估方法，只有高风险率发生较大升高的采血点其标本质量才会引起产筛中心的注意。笔者所在单位下某一采血点，在7、8、9三个月的产前筛查高风险率明显上升，超过8%，经联系后得知，其产筛标本分离时间为早上或者下午下班前30 min左右。而另一采血点，其12、1、2月份的产前筛查高风险率有明显上升，超过8%，经联系后得知，其实验室人员在冬天会将标本置于37℃水浴箱内，离心时间为下班前30 min。经过与实验人员的交流与培训，加强标本分离时间的管控，使用采血后室溫2 h内分离并保存于4℃冰箱，上述采血点的高风险率均得到有效控制。多数情况下，下属采血点对标本管理的不规范，所造成的是中风险区域（灰区）数量的显著增多，限于篇幅，在此不做进一步讨论。标本的规范管理，是产前筛查质控的重要环节，本文所得出的标本采集及处理环节对结果造成的影响，可以进一步明确温度与放置时间对结果的影响，有利于找出影响标本质量的环节，为产筛标本质量评估方法的研究提供参考。

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（收稿日期：2014-12-18）